文献综述

摘要：

易错PCR属于蛋白质的非合理设计范畴,它不需事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制,而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择),使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能的目的分子。UDP-糖基转移酶是催化ST甙合成RA甙的关键酶，在一定浓度Mn2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET28a-UGT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.比较进化酶催化底物ST甙的活性与亲本重组酶的活性。

1.1 甜菊糖和莱鲍迪甙A的研究背景

甜菊糖是从菊科甜叶菊的叶片中提取的一种天然甜味剂，其通式为(C5H8)4。甜菊糖是从甜叶菊中精提的甜菊糖一种高甜度、低热量的天然甜味剂，安全性高，无副作用，成为我国继蔗糖、甜菜糖之后的"第三糖源",在国际上被誉为"植物糖王"。甜菊糖甙可广泛应用于食品、饮料、调味料、酿酒、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业[1~4]。

目前从甜叶菊中分离出来的甜菊糖甙共有8种[5]:其中占最主要的是Stevioside成分（ST甙）[6,7,8]，约占总量的 60%~70%，甜度虽约为蔗糖的300倍，却有后苦涩味。Rebaudioside A（RA甙），它是无色结晶。甜度为蔗糖的450倍，热值又很低。甜味纯正，最接近蔗糖，无后苦味，是甜菊糖甙中味质最好的成分，但其占总量只有约15%~20%[910]。

市售甜菊糖甙一般为含有5种成分的混合总糖甙，因口感较差，价格每吨在20万元，然而含有RA 80%以上的甜菊糖，市价比一般混合型甜菊糖要高4~5倍[11~13]。由此可见甜菊糖甙的甜度和口感主要取决于RA甙和ST甙的含量比例，甜菊糖中RA甙含量越高，其甜度越高，口感越好，商品价值也越大，甜菊糖品质也越好。因此提高RA甙相对含量成为改善甜菊糖味质与品质的关键。

1.2莱鲍迪甙A的研究进展

从查阅的文献可知，目前大部分研究集中于RA甙的提取技术以及口味的改善[14]，制备莱鲍迪甙A的方法主要有酶法改性、生物转化方法。酶法改性是利用酶的催化作用，在ST甙和RA甙上增加特定基团如葡萄糖基（Glc）或果糖基（Fru）单元，以使口味更接近与蔗糖，酶改性甜菊糖甜度为蔗糖的100倍左右。

生物转化的方法由于多样性和易操作性的优点在工业上得到了迅速的应用。生物转化的发展经历了野生型全细胞催化，基因工程微生物全细胞反应，以及利用系统分析和代谢工程进行全局性调控等几个阶段[15]。全细胞催化合成具有反应条件温和，反应过程简单易控，产率较高，环境友好，产物纯度高且易分离，成本较酶催化低的等特点[16]。全细胞催化方法现已经广泛应用医药工业中间体、糖苷等重要工业产品的生产中。利用基因工程异源表达重组酶或对酶进行定向改造在生物转化领域得到了迅速的发展。

1.3 糖基转移酶的研究

糖基转移酶的定向进化体外定向进化是改造酶的一种有效的新策略，主要是模拟自然进化进程，在一种酶的特定位置引入随机变异，再经由D N A 改组、交错延伸过程、随机引导重组等进行突变基因的体外重组，最终经筛选获得所需活性的酶。定向进化首先需要构建包含大量突变的基因文库，通常采用随机突变和基因重组的方式来进行。随机突变包括易错PCR和饱和突变等；基因重组包括D N A 重组、渐进式切割产生杂合酶、交错延伸法、随机引物体外重组、以及随机片段交换法等9种方法。构建糖基转移酶突变库最为常用的是易错PCR、饱和突变和DNA 重组等3 种方法

糖基转移酶是ST甙转换成RA甙的酶，Richman等[17]从甜叶菊的EST中分离到3种参与甜菊糖甙合成的UGTs（UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1）的基因。ST甙到RA甙由UGT76G1一步糖基化反应完成。无论是采用植物代谢工程或是利用生物酶转化获得高含量的RA甙，对于UGT76G1的研究至关重要。RA甙的产量的多少主要以糖基转移酶的活性有关，所以提高糖基转移酶的活性就可以增加RA甙的甜菊糖中RA甙的含量。