文 献 综 述

丁二酸是一种重要的基础化工原料，广泛应用于化工、材料、食品和医药行业。丁二酸是传统石油基产品，生产方法是用来自石油的丁烷通过顺式丁烯二酐生产。在重视节能减排和可再生经济的今天，生物发酵法生产丁二酸广受关注并成为研究热点。作为重要的绿色化工四碳平台化合物，丁二酸被美国能源部列为12种最具潜力的大宗生物基化学品之首。尽管已有报道多种微生物可以发酵生产丁二酸，但被认为最有产业化前景的是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。相较于产琥珀酸放线菌和大肠杆菌，需要昂贵的有机氮源培养，谷氨酸棒杆菌可以在简单无机培养基中生长良好，并且在传统氨基酸产业已有大规模应用先例（如谷氨酸、赖氨酸等），这在生产价格低廉的丁二酸工艺中，有明显的优势。

传统上，谷氨酸棒杆菌被认为是需氧的革兰氏阳性菌。2004年，Inui等人发现谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下可以生产乳酸和丁二酸，并对谷氨酸棒杆菌进行了改造，去除了副产物乳酸，过量表达丙酮酸羧化酶，增强固定CO2的羧化回补途径；建立了有氧产菌、厌氧产酸的两阶段发酵策略。在厌氧条件下，他们以高细胞密度50 (g cdw L-1)，以碳酸氢钠为CO2供体，批量添加葡萄糖生产丁二酸。丁二酸产量最终达到146 (g L-1)，产酸速率达到3.2 (g L-1)每小时，虽然谷氨酸棒杆菌为现有文献报道的丁二酸最高产量发酵菌种，但与产琥珀酸放线菌及大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌的单位生物量产酸速率并不高，只有64 (mg g cdw#8722;1 h#8722;1)。而为获得高密度菌体，采用浓缩的方法，在大规模生产中也非经济可行。

课题组前期从谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC 13032出发，也构建了敲除乳酸合成途径的谷氨酸棒杆菌产丁二酸菌种SA001，并建立了从有氧转厌氧的两阶段连续发酵过程。为了更适合于丁二酸工业化生产，采用了低生物量的策略。在有氧阶段培养12小时菌体后，菌体达10.0 (g cdw L-1)后，转入厌氧，以碳酸氢钠为CO2供体，每12小时添加30 g葡萄糖，82小时后丁二酸的产量最高可达80 (g L-1)。在厌氧产酸过程中，菌体量并无明显下降。除产物丁二酸外，主要副产物为乙酸，其它物质为痕量，这与Shohei等人的结果一致。但该实验结果的平均糖耗速率和产酸速率要明显低于Shohei等人的工作，这显然是由于生物量低的缘故；而菌种SA001单位生物量产酸速率为99 (mg g-1 (cdw) h-1)，要高于Shohei等人的结果，但是比多数文献报道的产琥珀酸放线菌或大肠杆菌工程菌要低。从该实验结果中发现谷氨酸棒杆菌厌氧发酵过程糖耗速率和产酸速率与乙酸量的密切相关，随着发酵液中乙酸浓度的增加，糖耗速率从起始12小时的2.45 (g L-1 h-1)，下降到最后12小时的1.39 (g L-1 h-1)，下降了43%；产酸速率也是相似的情况，下降了41%。这表明发酵液中乙酸浓度显著抑制糖耗速率和产酸速率。这种现象也普遍存在于其他微生物发酵过程，如大肠杆菌高密度发酵。如果在有乙酸存在时，能保持菌种SA001的初始阶段糖耗速率和产酸速率，将可以获得理想的丁二酸产量。最近，Boris Litsanov等人通过阻断乙酸合成途径、乳酸合成途径和丁二酸去路(Δcat, Δpqo, Δpta-ackA, ΔldhA)，整合表达丙酮酸羧化酶基因pycP458S，表达来源于Mycobacterium vaccae的NAD依赖的甲酸脱氢酶(FDH)提供还原力，使丁二酸生成速率达到1.59 (mmol g (cdw)#8722;1 h#8722;1)，葡萄糖到丁二酸的转化率达到1.67 mol/mol，但该过程需要额外添加甲酸，一定程度上增加了生产成本。

在谷氨酸棒杆菌厌氧发酵体系中，主要存在葡萄糖、碳酸氢钠、丁二酸和乙酸。葡萄糖浓度对谷氨酸棒杆菌的葡萄糖利用不是限制因素，低碳酸氢钠浓度影响产丁二酸速率，较高浓度有利于丁二酸的生产，谷氨酸棒杆菌也可以耐受高浓度的丁二酸，因此乙酸的量是影响糖代谢速率和丁二酸产生速率的主要因素。而在此乙酸的产生负责提供NADH，给经羧化回补途径产生丁二酸之用，通过基因敲除的方法，减少乙酸，将会影响丁二酸的产量。如何在有乙酸的情况下，保持糖代谢和产酸速率将成为实现谷氨酸棒杆菌厌氧发酵高产丁二酸的关键。

Inui等人所做的谷氨酸棒杆菌在缺氧条件下的代谢的转录分析报告显示，谷氨酸棒杆菌细胞在缺氧条件下的葡萄糖消耗高于好氧生长条件，DNA芯片和定量RT-PCR分析表明，在缺氧条件下的糖酵解和有机酸的生产途径，包括gapA-pgk-tpi-ppc基因簇、ldhA和mdh编码的几个关键酶的基因表达及转录水平显著上调，而其它基因表达及转录水平则有所下调，且TPI和MDH等酶活的比率显着高于其相应的基因表达的DNA微阵列分析的比率，这种差异可能与厌氧条件下相关酶的mRNA翻译及酶活性的稳定性有关，如要实现对其的控制需要更多的分析。

Nishimura等人发现谷氨酸棒杆菌R和ATCC 13032可以在厌氧条件下消耗硝酸盐生长，该研究在0.5%葡萄糖和30 mM硝酸钾添加的情况下实现了谷氨酸棒杆菌厌氧条件下的生长，这归因于谷氨酸棒杆菌中存在一个narKGHJI操纵子，其具有与大肠杆菌高相似性的narK基因和narGHJI操纵子的基因簇。narK基因编码一种硝酸盐/亚硝酸盐的转运蛋白，而narGHJI操纵子编码呼吸链上的硝酸盐还原酶。因此，硝酸盐的添加可能作为氧胁迫的信号，对谷氨酸棒杆菌厌氧过程的代谢机制造成影响，激活部分原有厌氧条件下表达降低的酶和酶系。针对谷氨酸棒杆菌厌氧发酵中较难保持稳定较高糖代谢速率的问题，可以基于谷氨酸棒杆菌利用硝酸盐作为终端电子受体在厌氧生长的独特性质，结合适当的分批补料或流加葡萄糖、碳酸盐等厌氧发酵工艺过程，通过合理浓度的硝酸盐添加，以期实现该菌株在长时间厌氧发酵中维持较高糖代谢速率的能力。

参考文献

[1] Inui M, Murakami S, Okino S, Kawaguchi H, Vert#232;s AA, Yukawa H: Metabolic Analysis of Corynebacterium glutamicum during Lactate and Succinate Productions under Oxygen Deprivation Conditions. Journal of molecular microbiology and biotechnology 2004, 7(4):182-196.

[2] Wendisch VF, Bott M, Eikmanns BJ: Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids. Current opinion in microbiology 2006, 9(3):268-274.