文 献 综 述

1 多酶共固定化技术研究进展

许多重要的生物转化需要多酶之间的协同作用来实现，如何构建、操纵和利用多酶体系来实现复杂的反应是生物加工过程面临的挑战之一。游离多酶体系同单酶体系一样在应用中也存在着对环境敏感、性质不稳定、易失活、产物难分离提纯等问题。随着多酶体系的研究应用，多酶固定化的固定化逐渐成为固定化技术研究领域的热点。

固定化方法可以分为建立在单酶固定化基础上的混合固定化酶技术和新发展起来的多酶共固定化技术。混合固定化酶是将单酶分别固定到不同载体上在同一反应体系重新混合。但由于酶固定在不同载体上，反应中底物产物的传质要克服双重扩散阻力，使酶促反应受到限制。多酶共固定化（Coimmobilization）是将多种酶固定在同一载体上，能将不同酶的特点充分发挥并相互结合起来，同时有效解决多酶载体间的传质问题，通过减小传质路径缩短底物产物的转运时间，提高多酶体系的催化效率和使用稳定性，并更加有利于产物的分离提取，从各方面降低生产的成本。多酶共固定化时，不仅要考虑各种不同酶自身对催化效率的影响，还要考虑它们之间相互作用的影响。比如，各种不同酶反应速率不同，不同酶种之间的相互作用可能影响酶的活性，因此需要合理的调节以达到理性固定化多酶体系的目的。多酶共固定化技术的应用解决了混合固定化中多酶间的传质问题，通过减小传质距离缩短了底物的转运时间，同时提高了多酶体系的效率和使用周期，更加有利于产物的分离提取，从各方面降低了生产的成本。

Leduc 在 Nature Nanotechnology 中提到了#8220;仿生微工厂#8221;的概念，并详细介绍了纳米微工厂的构成的基本要素，对于多酶固定化载体的设计具有很强的指导意义。对于多酶固定化体系，主要包括以下几个主要的因素：（1）结构性外壳（structural shell）即#8220;厂房#8221;；（2）#8220;生物分子机器#8221; 酶（biochemical machinery）；（3）#8220;厂房#8221;通道以保证底物和产物的自由进出。结构性外壳的设计是#8220;仿生微工厂#8221;制备关键性的第一步，目前许多技术和方法都可以在微米及纳米尺度制备多空支撑材料作为仿生微工厂的结构性外壳，如脂质体、 二嵌段共聚物、纳米微球等。对于酶固定化载体，支撑的外壳应该达到两方面的要求：第一，要给酶提供一个较好的微环境；第二，要有一定的稳定性。#8220;仿生微工厂#8221;必须能够控制物质的进出其包埋层，保证反应物和反应产物的由进出的同时还要防止酶的泄漏，以确保反应体系的稳定性。自然界中生物细胞通过细胞膜的屏障可以很好地控制物质进出，但这是一个十分复杂的过程，包括 channels、endocytosis, and lipid rafts 机理，目前我们还不能很好地模拟细胞膜的功能，可采用的方法主要是利用载体蛋白或者材料的孔径实现对物质进出的控制。

在微工厂#8220;笼效应#8221;的作用下，生物分子可以大大地提高反应转化率和效率，这对于多酶固定化具有特殊的意义。将不同的酶局限于一个较小尺度的空间，相对于游离的分散体系，形成了一个酶的#8220;生产线#8221;，这样不同酶活性位点更加接近，改变了反应底物与中间产物的扩散梯度，从而使串联反应发生的可能性得到提高。

2 人工细胞

Chang于 1964 年首次提出了#8220;人工细胞#8221;的概念，并将其应用于医学领域。模仿细胞的结构可制备出大小与生物细胞相近的微囊，将胰岛包埋在微囊中，可解决宿主对移植物的免疫排斥反应。这是因为微囊的囊壁具有半透膜功能，只允许小分子营养物和代谢产物通过，阻止大分子免疫球蛋白的透过，从而避免免疫损伤。具有较好生物相容性的#8220;人工细胞#8221;是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊。

近来，#8220;人工细胞#8221;又被应用于固定化酶领域。无论是低等生物还是高等生物，其生物体均是由细胞组成的。酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质，这些酶大部分位于细胞内，小部分分泌到细胞外。酶在细胞内存在的部位不同，有些酶是#8220;可溶的#8221;，并不直接与细胞中任何特定结构组分相连，如细胞液中的酶；另一些酶则是#8220;不溶的#8221;，它们与细胞膜或细胞器结合，较难与细胞的组分分开，如线粒体上的酶。根据酶在细胞中的存在形式，可相应设计不同类型的仿生固定化酶载体#8212;即#8220;仿生细胞#8221;。以分子聚集体和微多相体系所提供的纳米、微米空间的#8220;仿生细胞#8221;的研究集中在实现酶的多活性位点的联合作用，多酶的串联反应，研讨利用微工厂控制化学反应方向，提高化学反应的选择性。

仿生细胞思想为酶固定化尤其是多酶共固定以及辅酶再生系统的设计提供了一些思路。Wang 等首先将甲酸脱氢酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶和电子供体 NADH分别共价键合于纳米颗粒的表面，再将上述纳米颗粒共同包埋于多孔的聚合物微囊中，获得尺寸小于 100μm 的仿生细胞。仿生细胞的囊壁具有纳米孔，能确保底物和产物的扩散，同时防止纳米颗粒的泄漏。因为仿生细胞的内部环境具有一定的流动性，所以能在三种酶的催化下实现二氧化碳向甲醇的高效转化。仿生细胞重复使用 11 次，固定化酶的活力仍维持在 80%以上。