文 献 综 述

随着时间和科技的发展，基因工程药物渐渐走入人们的视野。所谓基因工程药物就是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去(包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞)，在受体细胞不断繁殖，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物[1]。基因药物的发展史：第一阶段人们将具有药用价值的蛋白质导入细菌中，如大肠杆菌等，使其在细菌细胞中得到表达，但这种方法得到的蛋白药物的功效往往不佳，因为人类基因为真核基因，作为低等生物的细菌不能表达或表达的蛋白无活性，不能对疾病有所作用。第二阶段是人们用哺乳动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物[2]。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。作为生物技术专业本科毕业生，在现有的知识基础上，基于基因药物的了解和认识，对于第一阶段中药用蛋白的表达（包括在原核细胞和真核细胞中的表达）通过文献查阅进行了比较后，选择了在大肠杆菌中对Anti Protein X进行了表达纯化和相应的生物学和免疫学的活性鉴定，以进一步对所学的知识加深了解并进行实际的运用。

1.本课题研究现状

随着现代生物技术的发展，利用各种表达系统进行外源基因表达成为商业蛋白生产的重要手段。各种表达系统又分为真核表达和原核表达，本课题主要研究原核表达，而原核表达又分为大肠杆菌表达系统，酵母表达系统以及丝状真菌表达系统。

1.1真核表达与原核表达的比较

基因组是构成、经营和调节生物体并且传递生命到下一代的整套遗传指令，包括有机体的全部遗传特征[3]。真核生物的遗传物质集中在细胞核中，并与某些特殊的蛋白质组成核蛋白，形成一种致密的染色体结构，如酵母、霉菌、高等动植物。原核生物没有细胞核，遗传物质分散于整个细胞中，有时虽有相对集中的区域，但并无核膜保卫，如放线菌、细菌、立克次氏体、衣原体、支原体等。由于二者的细胞结构不同，它们的基因组及其基因表达调控差异明显[4]。原核生物的基因组结构特点：①染色体数量少。一般只有一条染色体，及一个核苷酸分子，无细胞核。 ②DNA结构特点。大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在。核苷酸大多数为环状，少数为线状。有些细菌有染色体外遗传因子，既质粒RNA。③基因组小，结构简单。DNA一般只有单一复制起点。基因组中有数百个至数千个基因。基因组内核苷酸大多数序列用于编码多肽以及tRNA，rRNA等，仅少量的非编码核苷酸序列构成调控元件，如启动子。基因的编码序列通常是连续的，中间物非编码成分。④转录单元。原核生物基因组中，功能相关的基因丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控，它们可被转录为多个mRAN分子，叫多顺反子。操纵子是最具典型的模式。⑤重叠基因。一些细菌同一段DNA能携带不同的蛋白质信息。鸡同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子[5]。真核生物的基因组结构特点：①染色体数量多，结构复杂。由几个或几十个更多的双链DNA分子组成。存在以核小体为单位的染色体结构，这是原核生物基因不具有的。核小体是绕在4对组蛋白H2A，H2B，H3，H4所组成的八聚体核心外两周，并含有连接区的一个分子的H1组蛋白，整个DNA分子与蛋白质稳定地结合[6]。②DNA结构特点。都是双链双螺旋结构，核苷酸分子多数为线状。含有与原核生物不同的染色体外遗传因子。③基因组大，结构复杂。DNA有多个复制起点。每个基因组中含有数万个基因。④重复序列。通过对基因组的复性动力学和密度梯度离心研究[7,8]，真核生物与原核生物的DNA复杂性很不相同。真核生物在DNA复性时，除了其复性曲线与原核生物DNA部分相似外，还有一部分很快地复性。⑤基因家族。真核基因都是单顺反子，许多功能相关的基因成套组合，形成基因家族。同一家族的各成员的核苷酸序列彼此相似，具有同源性。⑥断裂基因。真核生物无操纵子，基因是不连续的，同一基因的编码序列被数量不等的非编码间隔隔成多个较小的片段，编码蛋白的片段叫外显子（exon），非编码蛋白的片段叫内含子（intron）。基因组中不编码的区域多于编码区域，因此真核基因被称为断裂基因。内含子虽不被翻译，但特定的核苷酸序列对RNA的精确加工是必不可少的。

1.2 几种微生物表达系统的比较

微生物表达系统具有培养简单，周期性短，成本低等优点，是商业性蛋白重要的表达来源。主要分为有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统以及丝状真菌表达系统。大肠杆菌作为生命科学研究的模式生物之一，其在遗传学背景及基因表达调控机理的研究早已得到完善，而且拥有多种适应不同表达的载体和宿主菌。大肠杆菌可以表达多种多肽和蛋白质，具有生长繁殖快，培养简单，低成本，表达量高的特点，目前已成为实验室首选的外源表达系统。原核蛋白在大肠杆菌体内表达，可以得到天然构象[9]。作为低等真核生物的酵母菌，是一种单细胞生物，真核基因能被其识别转录进行修饰继而表达，形成胞外蛋白分泌到细胞外。酵母菌由于安全可靠，培养周期短，生长迅速，操作简单，又能弥补原核表达系统在表达真核基因方面的不足，因此成为最普遍的真核表达系统之一[9]。丝状真菌对于生长环境的要求低，具有高效的表达和分泌蛋白的功能，而且它表达的蛋白具有很高的利用价值等优势，使其在很长的时间内都被人们关注。丝状真菌自身能够产生丰富的次级代谢产物，其中的大多数已经成为生物技术下的产物，并成为具有临床意义的药物。除发现有少数自主复制质粒的转化外，丝状真菌一般是整合转化，筛选的重组子稳定，有利于遗传育种[10]。

1.3大肠杆菌表达系统的特点

大肠杆菌表达系统的优越性：大肠杆菌已成为一种安全的基因工程试验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；许多真核基因，例如抑生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中有效的，高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。原核表达的局限性：（1）外源基因不能太长，最好600~800bp。缺少真核生物转录后加工系统;（2）插入外源真核基因不能有内含子，原核细胞缺乏翻译后加工功能;(3)表达产物常常形成包涵体，必须经化学处理才能得到有活性的蛋白质;（4）表达的真核基因产物在原核寄主细胞中不稳定，易被细菌蛋白酶降解，往往需融合表达来改善;（5）表达的真核生物蛋白质产物不能被糖基化和磷酸化[11]; (6)原核表达的蛋白质不能保证原来的空间构型; (7)大肠杆菌致热原使表达产物难以应用于临床。