国内外研究现状、应用、发展动态

1、酵母菌的形态、生理生化特性

酵母菌细胞长度为1～10micro;m，宽1～5micro;m，酿酒工业用酵母菌细胞的直径多为4～6micro;m[11、12]。各种酵母菌有其一定的形状和大小，但也随菌龄及环境条件而变化。酵母菌的菌落表面光滑、粘稠，容易用接种针挑起。颜色均匀，质地均一。有的酵母菌因培养时间较长菌落会有皱缩现象。大多数酵母菌菌落呈乳白色，不透明，极少数为红色（如红酵母与掷孢酵母等）。菌落的色泽、质地、表面及边缘等特征都是酵母菌菌种鉴定的依据。酿酒酵母在麦芽汁培养基上的菌落为乳白色、有光泽、边缘整齐。在加盖片的玉米琼脂上培养，不生成假菌丝或者不典型的假菌丝。

酵母属酵母也像高等真核微生物一样，具有特征的亚细胞结构和细胞器。它们具有细胞核、内质网、高尔基体和分泌的液泡。线粒体也在细胞中存在。因为它们的发酵性质，酵母细胞可以去除线粒体而存在，形成所谓呼吸缺陷型。呼吸缺陷型菌株不能在非发酵基质（例如乙醇、丙酮酸和乳酸）上生长，但可以利用发酵性糖而生长。在厌氧发酵中，线粒体活性受到抑制，电子传递链中的酶不能合成。除了呼吸作用之外，许多氧化性反应是在线粒体中进行的，所以在发酵过程中不起作用。这些氧化反应包括三羧酸（TCA）循环、脯氨酸氧化和脂肪酸合成。另外酵母中的液泡是水解大分子物质和储存氨基酸、某些高能化合物和其他细胞组分的地方，液泡还能调节细胞压力和维持离子平[13]。

2、分子生物学技术在酵母菌鉴定中的应用

近两个世纪以来，酵母菌分类鉴定主要依据形态学和生理生化特点 由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属 种在形态学及生理生化特征方面差异极不显著，采用传统方法对它们进行鉴定相当困难，需要用大量有效的试验来说明传统分类学的数据，以避免微小的生理不同而导致的菌种鉴定错误 传统分类学中鉴定标准存在的最大问题是在生物等级分类系统中随分类的递减，分类标准仅建立在微小的表型或生理差异上 然而这些微小差异只有通过分子研究得到可靠的遗传支持才能被完全证实[14]近年来，随着分子生物学的发展，分子生物学技术已被应用于酵母菌的分类鉴定研究中，不断弥补了由形态学和生理生化鉴定方法带来的缺点和不足。分子学方法主要以核酸作为研究对象，研究的是其基因型，而不是表型，因而能反映其遗传本质。其稳定性好，易确定同源关系，便于计算机分析，因而加快了鉴定速度，增强了鉴定的可靠性。

2.1 摩尔百分含量分析

早在上世纪 60 年代，人们就开始认识到微生物染色体中的 G C 含量有较大的不同，这种 G C含量的不同是微生物物种的一个重要的遗传指标，可作为微生物分类鉴定的重要手段。这是最早用于酵母菌分类学研究的分子生物学技术，因为每种酵母菌都有固定的 DNA G C 百分含量范围且较为稳定，因而可以作为酵母菌分类学指标。一般认为，DNA G C 摩尔百分含量在种内变化不超过3 ，属内变化不超过 10 [2]但是 G C 摩尔百分含量只能从一定程度上间接地反映菌种属间的亲缘关系，有些完全不相关的两种菌也可能有相同或相似的 G C 摩尔百分含量。因此，在分类中使用这一指标时，要与其它基因型指标结合使用，因为 G C 摩尔百分含量反映的只是 DNA 的碱基组成而非一级结构中碱基序列。通常酵母菌的G C百分含量在 27%到70%之间，担子菌酵母百分含量多为 50%到70% ，而子囊菌酵母的百分含量一般为27% 到50 %，G C 摩尔百分含量的测定方法主要有3 种，即热变性法（Tm ） 浮力密度法（超速离心）和高效液相色谱法（HPLC ），其中以热变性法最为简单常用。

2.2 脉冲电泳核型分析

应用脉冲凝胶电泳（PFGE）技术，可以在琼脂糖凝胶电泳中用两个或多个不同方向的交替电场分离酵母染色体DNA分子。当电场方向改变后，DNA 分子用于改变构型与调整泳动方向所需时间和在新电场电泳方向。泳动时间与 DNA 分子量大小密切相关，从而估算酵母染色体条数及每条染色体 DNA 的大PFGE 先后经历了5种类型，其中钳位均匀电场电泳（CHEF）吸取了其他方法的优点，根据静电场原理，将 24个电极均匀排列在等六边形周边，从而在六边形中央形成脉冲式匀强电场。它具有DNA带直、分辨率高、凝胶板可用于分子杂交等特点[15]白逢彦等还用此法对酿酒酵母中的部分疑难菌株进行了进一步分类[16]。

2.3 随机扩增多态 DNA（Random AmplifiedPolymorphic DNA）

RAPD（随机扩增多态DNA ）是Williams J和Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一项多态分析新技术，是在 PCR 技术的基础上发展起来的。其原理是利用合成的随机排列的寡核苷酸引物（10kb），在宽松的条件下，通过反应扩增靶细胞由于不同物种或同种的不同菌株之间的基因组中可能存在插入 缺失、重组而导致基因序列的改变，扩增产物的长度会有所不同，经凝胶电泳分析片段大小和数量多态性，从而比较受试菌株基因差异的一种技术 适用于遗传背景不清的基因分析，能对整个基因组序列做大致的分析。一般而言，分析并不适用真菌种间的系统发育及其亲缘关系，而对种下水平的分类学有较好的分辨率所以对研究种群遗传结构及种下分类是有用的[6Pafetti 等对分属于接合酵母属和酿酒酵母属的19株酵母菌进行了鉴定，共采用了5个引物，结果与 RFLP 的分析相一致 。RAPD 也可比较种属间的差异，Xufre 等分析了6 株酒用酵母的微小差异，确定它们的亲缘性从40至80不等，这些差异通过传统方法和扩增 ITS1 ITS2 都无法区分[17] RAPD 的主要缺点主要是 RAPD 标记中的DNA 染色带往往是一种混合标记，是在基因组DNA 中扩增位点不一 长度可能相同或不同的一组片段的混合片段标记 此外，RAPD 的扩增带多为显性标记，不能区分个体基因型是纯合型还是杂合型，稳定性和重复性较差[18]。

2.4 DNA 限制性酶切片段多态性（RestrictionFragmen Length Polymorphism ）

RFLP （DNA 限制性内切酶作用片段多态性）是指每种 DNA 限制性内切酶都有特定的作用位点，来源不同的菌株的 DNA 分子，结构和序列不同，用某一限制性内切酶作用后，会形成大小不等的一些片断，凝胶电泳后，形成特异性图谱 分析图谱可以达到区分菌株的目的，通过与模式菌株的图谱比较来鉴定菌株 Lee 等用此方法成功地找到了葡萄汁酵母种内的不同株与酿酒酵母之间的差异[19]Esteve-Zarzoso等利用 I Ⅲ I3 种内切酶消化扩增后鉴定了从食物中分离出的132 株酵母菌，它们分别属于 25 个属，并且获得每一种的特征图谱[20]Fern dez-Espinar 等扩增了5.8S rRNA，包括了内转录区间 ITS1 和 ITS2，以此对雪利酒中的酵母菌进行 RFLP 鉴定分析[21]另外，线粒体 DNA 的分子进化速度比核 DNA快，因而线粒体 DNA 分子的分析对真菌种内和种间的分类会更灵敏[22]Pramateftaki V等用RFLP分析了酿酒酵母线粒体DNA，表明其种内基因的多样性[23]RFLP的局限性在于它要求选择扩增特异性的DNA片段，要求对所研究的物种DNA序列文库清楚，而真菌属种多样复杂，其中大部分的基因组序列未知或不清楚，从而限制了它的应用。

2.5 序列分析

随着 DNA 序列分析技术的日趋成熟和简易化，序列分析方法已经被广泛应用于酵母菌的分类鉴定以及系统学研究。其中，rRNA 基因（rDNA）及其转录间区（ITS）的序列是最为常用的，包括18S rDNA 26S rDNA的D1/D2 ITS 5.8S rDNA[24]这些序列均己经公布于 GenBank/EMBL/DDBJ 等国际核酸序列数据库，为酵母菌的分类鉴定带来极大的便利 序列分析的大致流程是：活化菌株，

提取目的菌株的基因组 DNA，并以此为模板使用酵母菌通用引物扩增相应的区域，扩增产物经电泳检测，纯化后进行测序；将测序得到的序列提交到 GenBank 等核苷酸数据库，与库中所有酵母菌的同源序列进行相似性比较，与相似度最高的序列的碱基差异越小，成为该序列所对应菌种的可能性就越大 也可以从核苷酸数据库中下载同源序列，构建系统发育树，研究菌株的系统发育地位。

2.6 DNA-DNA杂交

虽然目前已能够对长达几千个碱基的 DNA 片段进行序列分析，但进行全序列分析实际操作中仍有难度。然而，DNA杂交可以找出DNA之间的核苷酸序列互补程度，从而推断不同酵母菌基因之间的同源性。将2个菌株的变性DNA混合在一起，在一定条件下单链DNA分子复性形成杂合分子，亲缘关系愈近的菌株，DNA 序列就愈相似，从而复性就完全，即同源百分率越高 DNA 同源性分析一般用于区分形态学方法不易鉴定的酵母种类，最适于亲缘关系较近的菌株[25]现在普遍认为同源率在70%以上代表同一种，同源率40%到70%之间的代表同一种内亲缘关系比较远的菌株，40以下则被认为代表不同的种[26]测定方法主要有固相法和液相法，固相法是将DNA固定于支持物滤膜上，通过DNA间的相对结合率来计算同源率的一种方法；而液相法的DNA-DNA杂交在溶液中进行，通过测定其熔点温度差异来计算同源率。

Vaughan-Martina 和 Kurtzman 的 DNA-DNA 同源性的研究S.cerevisiae 是个非自然种，并确立了狭义酵母组中的 4 个种的地位[27]根据 DNA-DNA 同 源 性 和 脉 冲 电 泳 核 型 分 析 的 结 果 Vaughan-Martin 分别在广义酿酒酵母组中建立了 3个新种，并从 Pachytichospora 属中移入 1 个种[28]Takahito 等报道了一种新的 DNA-DNA 杂交方法，即拥有约 6000 个酵母基因的 DNA 微阵列比较基因组杂交法 结果显示，属于酵母属内的供试株基因组杂交特征与参照菌株 Saccharomyces cerevisiaeS288 明显不同，指出该法是一种非常具有潜力的菌种鉴定方法[29]。

综上所述，每一种方法都有其优点及局限性，仅靠一种方法很难鉴定出所有的酵母菌种，因此将某些方法结合起来就可能大大提高酵母菌种鉴定的准确性，应用分子生物学技术鉴定酵母菌种还有待进一步发展和完善。

3、酵母菌分类鉴定技术展望

酵母菌鉴定的发展趋势应该是向简单、快速、准确的方向发展，但每种鉴定方法都有自身的适用范围，单一的鉴定技术不能完全胜任酵母菌的分类定， 只有同其他方法结合起来进行比较研究才能得到更为可靠的结果，如将传统方法和分子生物学方法结合起来才可以避免由于单一方法原理本身局限所引起的偏差，提供更加全面、准确的菌种信息 2007年，夏青等［30］结合传统鉴定方法与脉冲电泳核型分析成功鉴定了8株国外引进的酿酒酵母此外，利用同一分子生物技术鉴定不同的基因区，也可以达到较好的鉴定效果。因此为了得到酵母菌菌种更为准确和完整的信息，综合包括分子、生化、形态等多种鉴定技术建立一套能够全面分析菌种特性提供菌种多方位信息的多相鉴定技术体系，并使之成为酵母菌鉴定的标准化操作规程是非常必要的此外，为了适应工业化生产需求，在葡萄酒酿造发酵过程中利用构建的多相鉴定体系对野生菌株和生产菌株的基因型进行快速、准确的鉴定，研究接入的优良菌种在发酵过程中是否占主导地位，并防止杂菌污染，对保证生产稳定和产品质量意义重大。

随着分子生物学和相关技术的发展，分子生物学技术以其准确、快速、灵敏等优点逐渐成为微生物分类鉴定的重要手段，并且已经取得了较好的效果， 解决了大批传统方法难以确定其分类学地位的酵母菌株分类鉴定问题，可以预见，结合分子生物学技术的多相鉴定体系将成为酵母菌分类鉴定的最有效段 。

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1.本课题拟研究或解决的问题

本文通过对从汤沟酒厂的大曲、酒醅和窖泥样品中分理出的疑似酵母菌的乙醇生产菌株的研究，对其生长特性进行研究，对这些菌株从形态、生理生化和分子三个角度进行种属鉴定，并对酵母菌的培养方法进行初步探讨，对实验数据进行处理分析，为今后的研究奠定理论和实践基础。

2.拟采用的研究手段

（1）利用显微镜观察菌株菌落形态，繁殖方式，是否产生假菌丝等辨别其可能的种属。

( 2 ) 利用Biolog分析菌株生理生化特性，并进行碳源同化验证试验。
( 3 ) 提取菌株的 18s RNA ，分析菌株的进化和系统分类。