1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

1. 乳酸简介

乳酸（Lactic acid）又名α-羟基丙酸（α-hydroxypropionic acid）,1780年由Scheele从酸牛奶中提取出来而得名，其分子式为：C2H5OCOOH，分子量90.08，是世界公认的三大有机酸之一，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，是生物的代谢中间体及代谢产物。乳酸的分子量为90.08，分子中有一个不对称碳原子，因此有旋光性，分为D(-)-乳酸和L(-)-乳酸 [1]。

D-乳酸和L-乳酸彼此互为镜像、不能叠合，均属手性化合物，除旋光性外，其它理化性质几乎完全相同(见表1)。其中只有L-乳酸能被人体吸收利用，有些微生物可以代谢产生和利用D-乳酸。

表1 乳酸的物理常数[2]

2. D-乳酸的应用

乳酸及其衍生物主要应用在医药、化妆品、制革、食品、酿造、卷烟、纺织等众多领域；它还可作试剂、增塑剂和粘合剂等。其衍生物如：聚乳酸、乳酸盐、乳酸酯等的用途也极其广泛[3]。高光学纯度D-乳酸（光学纯度97%以上）甲酯在医药、农药除草剂方面的实际应用引起人们的重视[4]。

近年来乳酸有了一个重要的新用途,即聚乳酸类生物降解塑料[4]。聚乳酸(PLA)是一种无毒的高分子化合物,具有与聚苯乙烯相似的光泽度和加工性能，但具有更合适的生物降解性和更优良的生物相溶性，常用作医用缝合线、外科矫正材料和药物控释载体[8]。但是PLLA降解吸收速度较慢，在体内的完全降解吸收时间可达2-8a，因而又是无菌性炎症反应的主要诱因，因此，在保证力学性能的基础上，适当降低其结晶度的材料对医学应用来说是可取的，所以目前用PLLA和PDLA共混复合来调控最终材料的降解速度是研制开发降解性能可调的材料的重要途径[5,6,7]。

3. D-乳酸发酵机理及发酵研究

乳酸的制备方法有发酵法、化学合成法和酶法[8]。化学合成法采用石油裂解来源的剧毒原料进行生产，生产过程存在严重的环境污染问题，并且合成的乳酸均为外消旋D,L-乳酸，不能适应市场对光学纯乳酸的需求；酶法虽可制备光学纯乳酸，但成本较高，无实际应用价值；发酵法以葡萄糖、蔗糖、淀粉水解物等可再生性资源为原料，根据菌种所含乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）种类的不同可生产L-乳酸、D-乳酸和D,L-乳酸，是目前乳酸的主要制备方法。

图2 乳酸同型发酵途径

同型乳酸发酵是乳酸菌利用碳源经过糖酵解（EMP）产生丙酮酸，然后在乳酸脱氢酶的催化作用下生成乳酸（图2）。该途径中，1mol葡萄糖可生成2mol乳酸，理论转化率为100%。但由于微生物生理活动的存在，一般认为转化率在80%以上者即为同型发酵。同型乳酸发酵是工业用菌种理想的发酵类型。

具有较高光学纯D-乳酸的乳酸细菌主要分布在乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）和明串珠菌属（Leuconostoc）四个属。目前，国内外研究较多的D-乳酸生产菌主要集中在乳杆菌属和芽孢乳杆菌属，其发酵性能概括见表3。

表3 D-乳酸发酵性能比较[8-21]

4. 固定化细胞技术及其在乳酸发酵生产中的应用

细胞固定化技术是利用物理或化学手段将游离的微生物(细胞) 或酶 ,定位于限定的空间区域 ,并使其保持活性且能反复利用的一项技术[22]。

固定化细胞主要优点有以下六点。①节约酶的分离过程及费用；②属于多酶系统，无需辅酶再生；③细胞生长停滞时间短；④固定化细胞可以重复或长期使用，简化游离细胞培养过程，还减少了营养基质的浪费；⑤保持酶的原始状态，提高酶的稳定性；⑥使用固定化细胞反应塔连续发酵，可以避免反馈抑制和产物的消耗。

细胞固定化的性能，取决于细胞固定化所使用的载体材料的性质和固定化方法。目前制备固定化细胞的方法有吸附法、包埋法、共价法、交联法等方法[23]。固定化细胞技术中所使用的载体材料而言，主要分为三大类：有机高分子载体、无机载体和复合载体。人们对一种较为理想的固定化细胞载体的要求是：具有高的载体活性，即固定化细胞的活性回收率要高；材料容易获得；价格便宜；操作制备方便，能适用于大规模生产；有较高的机械强度，能较长时间使用和重复使用[24]。实验表明，海藻酸钠固定化细胞具有较好的扩散性和强度，在水解试验中与游离细胞相比，酶活收率可达到80％以上，而且具有较好的温度和批次反应稳定性。固定化细胞技术是在固定化酶的基础上发展起来的，因其具有酶活力损失少、成本低和生产周期明显优于固定化酶等优点 ，使其在工业上更具应用潜力[25]。

张全国，李鹏鹏，荆艳艳等人研究了不同包埋材料的包埋法固定化光合细菌的产氢能力，结果表明琼脂、海藻酸钠、PVA-硼酸固定光合菌体对光合细菌的产氢量、产氢速率、比产氢速率都有不同程度的提高，海藻酸钠固定化光合菌体对产氢最为有利，比游离态产氢量提高15%～40%，平均产氢速率是游离态产氢速率的1.37倍；琼脂次之，比游离态产氢量提高8%～15%；PVA-硼酸包埋光合细菌产氢能力在前3天内有较好的效果，但随着时间的延长反而不及游离态状态下产氢，72 h以内的产氢量比游离态产氢量提高10%～20%。聚丙烯酰胺包埋光合细菌的产氢量还不到游离态产氢量的60%，所以聚丙烯酰胺不适宜作为光合细菌产氢时的包埋材料。[26]

本实验室也将采用不同的包埋材料对菊糖芽孢乳杆菌ATCC15538发酵D-乳酸进行研究，主要采用琼脂，海藻酸钠，多聚糖以及多种吸附方法进行对比研究，主要通过测定发酵液的PH，OD，残糖和乳酸含量观察细菌的生长状况以及发酵速率，通过分批发酵观察每批发酵所需时间，从而鉴定海藻酸钠是否为最合适的固定化试剂。

5. 本课题研究目的与意义

由于D-乳酸生产菌种多数专性或兼性厌氧，较低的菌体密度直接导致了发酵周期长、生产效率低，这一现象已严重制约了D-乳酸发酵生产的进一步发展。本课题首先考察不同包埋试剂对D-乳酸发酵的影响，从而筛选出最有效的包埋试剂，这样就缩短发酵周期、提高生产效率。

参考文献

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[25] 海藻酸钠复合载体固定化细胞拆分D，L 泛解酸内酯 王雪梅 于明锐 谭天伟( 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 1 0 0 0 2 9 )

[26] 包埋法固定光合细菌技术对光合产氢能力的影响 张全国，荆艳艳，李鹏鹏，尤希凤，师玉忠(河南农业大学机电工程学院，郑州 450002)

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究解决的问题

(1) 摇瓶条件下，各种包埋材料对发酵产酸过程的影响

(2) 不同海藻酸钠浓度，氯化钙浓度对固定化效果的影响