摘 要

赤霉素作为植物生长激素可促进细胞分裂与分化，在植物生根、种子发育、结果等过程中起着重要的调节作用。目前赤霉素的主要生产菌株为藤仓赤霉菌（Fusarium fujikuroi），因此本研究旨在对藤仓赤霉菌进行改造以希望提高赤霉素的生产能力。CRIEPR/Cas9技术可以对多基因的同时编辑，且可以实现定向切割，具有高效快速等优势。因此本研究希望在藤仓赤霉菌中构建CRIEPR/Cas9系统以对该菌进行定向改造，提高其产赤霉素能力等。在此过程中，我们设计通过导入SV40_NLS、HTB_NLS、VEL_NLS三种核定位信号与fFuCas9蛋白单独融合以在F. fujikuroi中建立有效的CRISPR / Cas9体系，最终发现HTB_NLS的效用最高，突变率达到41.7%。最后，我们又对sgRNA采用体外和体内转录两种表达策略来改善其不稳定性，实验表明5S rRNA作为启动子驱动sgRNA表达时，编辑效率为79.2%，体外表达则采用T7启动子。这为以后赤霉菌生产赤霉素的进一步改造提供了一定思路与研究基础。

关键词：CRISPER-Cas9 藤仓赤霉菌 基因编辑 5S rRNA 赤霉酸

Establishment of an efficient CRISPR/Cas9 system in F. fujikuroi

ABSTRACT

As a plant growth hormone, gibberellin can promote cell division and differentiation, and plays an important regulatory role in plant rooting, seed development and results. At present, the main production strain of gibberellin is Fusarium fujikuroi, so this study aims to transform F. fujikuroi in order to increase the production of gibberellin. CRISPR/Cas9 technology can be used to simultaneously edit multiple genes and achieve directional cleavage, which is efficient and fast. Therefore,we want to establish the CRISPR/Cas9 system in F. fujikuroi to directly modify the metabolic pathway and improve its gibberellin-producing ability. In this process, we fused the SV40_NLS, HTB_NLS, and VEL_NLS nuclear localization signals with fFuCas9 protein separately to compare the efficiency of CRISPR/Cas9 system in F. fujikuroi. Finally, HTB_NLS was found to have the highest efficacy with a mutation rate of 41.7%. Finally, we used two strategies including the in vitro and in vivo sgRNA expression strategies to improve the system instability. Experiments results showed that 5S rRNA can be used as a promoter to drive sgRNA expression with an highest editing efficiency of 79.2%. This gives a certain method and research basis for the further research of Gibberellin production in F. fujikuroi.

Key words：CRISPR/Cas9 F. fujikuroi gene editing 5S rRNA gibberellin

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1藤仓赤霉菌简介 1

1.1.1赤霉素的结构、性质与功能 1

1.1.2 Fusarium fujikuroi的代谢途径 2

1.2 CRISPR-Cas9简介 4

1.2.1 CRISPR/ Cas9技术原理 4

1.2.2sgRNA的表达策略 6

1.2.2 CRISPR/Cas9的应用前景 7

1.2 研究意义 7

第二章 实验材料与方法 9

2.1实验试剂与仪器 9

2.1.1实验材料与仪器 9

2.2.2培养基 10

2.2.3菌株来源 11

2.2 F. fujikuroi 基因组提取方法 11

2.3质粒小量提取方法 12

2.4质粒浓缩方法 12

2.5.1 PCR方法 13

2.5.2 琼脂糖凝胶电泳 13

2.5.3 DNA胶回收方法 14

2.6质粒的连接与转化 14

2.6.1质粒酶切方法 14

2.6.2一步克隆 14

2.6.3质粒转化大肠杆菌方法 14

2.7菌落PCR 15

2.8酶解法制备F. fujikuroi原生质体 15

2.9质粒构建和引物设计 16

2.9.1不同核定位信号质粒的构建 16

2.9.2 5S rRNA启动子驱动的sgRNA质粒的构建 17

2.10 sgRNA体外转录方法 19

第三章 结果与讨论 21

3.1不同核定位信号的选取 21

3.1.1靶基因fcc1的筛选 21

3.1.2不同核定位信号介导sgRNA体外转录 22

3.2体内转录sgRNA 24

3.3sgRNA的体外转录 25

第四章 结论与展望 27

4.1结论 27

4.2展望 28

参考文献 29

致 谢 32

第一章 文献综述

1.1藤仓赤霉菌简介

藤仓赤霉菌（Fusarium fujikuroi又名Gibberella fujikuroi）是一种丝状真菌，其无性状态为串珠镰孢霉，是Sawada于1917年在台湾水稻茎干上第一次分离得到的[1]。由于该菌可以引发水稻恶苗病，所以赤霉菌在一定程度限制了农业生产与发展。为防治水稻恶苗病，我国目前主要采用化学试剂来消除该菌，但随着化学试剂的高频与多剂量应用，藤仓赤霉菌开始逐渐产生抗药性，故而水稻恶苗病的防治仍然面临着严峻的形式。尽管如此，但赤霉菌产生的次级代谢产物如比卡因素和赤霉素（Gibberellins, GAs）等都颇有价值与研究意义。其中，赤霉素所占比例最大，也最具有研究意义。

1.1.1赤霉素的结构、性质与功能[2]

赤霉素是一类四环二萜，属四环羧酸化合物[3]，在许多不同生物中都具有生物活性。纯净赤霉素呈白色晶体，高温可分解，易溶于醇类、丙酮、冰醋酸等有机溶剂，难溶于水。水溶液则呈酸性，遇碱易分解，干燥条件下可长期保存。

赤霉素作为一种天然的植物生长激素可促进细胞分裂与分化，在植物生根、种子发育、结果等过程中起着重要的调节作用，并且对棉花、麻类等作物生长也有一定效用[4]。鉴于其良好的生理功能及处理农作物时高效、快速、低成本的特点，已被逐渐应用于杂交水稻种植、蔬菜生长等方面从而促进农业、酿造业发展以获得较高的经济收益。目前已确定的赤霉素高达136种，但具有生物活性的种类很少，其中生物活性最高的是GA1、GA3、GA4和GA7（图1-1），没有生物活性的大都为活性赤霉素的前体或代谢物等[2]。尽管GA3使用最为广泛、生物活性最高、商业价值巨大，但GA4和GA7的混合物具有更加温和多样的效果因而逐渐受到越来越多的关注。然而GA4和GA7的生产更加困难，这一定程度上限制了它们的应用。

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