人类首条人工合成的基因出现在上世纪60年代 基因合成是当前合成生物学的主要内容，通过基因合成，可以获得自然界中不存在的基因，为人类改造生物开辟了一个全新的方向，在可预计的将来，基因合成将在生命科学领域发挥巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药等领域的作用已初步体现。同时我们也要对人工合成的基因进行检测。在检测基因时我们需要根据基因的GC含量来选择合适的检测方法和合适的检测条件。GC含量是指在DNA4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率称为GC含量。在双链DNA中，腺嘌呤与胸腺嘧啶（A/T）之比，以及鸟嘌呤与胞嘧啶（G/C）之比都是1。但是，（A T）/（G C）之比则随DNA的种类不同而异。GC含量愈高，DNA的密度也愈高，同时热及碱不易使之变性。高GC 含量一般指 GC含量高于60%。GC之间是三个氢键连接，而AT之间是两个氢键连接。导致结果便是高GC含量的片段解链需要的能量高，TM值高。其次，退火时相对于正常引物而言，高GC含量引物更容易与互补序列配对，但是，与相近序列配对的可能性也比正常引物高，导致易出现非特异性条带，难以检测到目的基因。因此要采取合适和高效率的检测方法来检测高GC含量的目的基因。

目前，常用的基因检测方法有以下几种：

1、转录水平检测^[1-3]：聚合酶链式反应（简称PCR）检测。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增, PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3）引物的延伸：DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的”半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)，使肉眼能直接观察和判断。在实验中就是运用专门仪器，使用dNTPS、Mg2 、特异引物、DNA聚合酶以及缓冲体系，加入模板也就是DNA样品进行体外扩增，结果进行电泳，如果能扩增出，并且扩增的产物大小与目的条带一致，那说明引物与模板特异，检测指标就是阳性。有研究者从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因组DNA中发掘得到了特异性很高的序列，并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系，检测到副溶血弧菌。

2、翻译水平检测^[4-5]：蛋白质印迹法(western blot)。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。人们利用蛋白质印迹法对健康SD大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达进行定量分析，成功测出GIRK4基因蛋白在健康SD大鼠肾脏组织相对表达量。

3、直接检测^[6-8]：采用报告基因或蓝白斑筛选方法等。报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因，通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况。蓝白斑筛选方法是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。在实验中如果转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。有研究人员结合蓝白斑筛选，人为改变阅读框架，致使野生型阅读框架中含有终止密码子TAA，缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子TAA，从而通过观察菌落的颜色来确定样品有无EGFR基因外显子19的碱基缺失突变。

虽然研究者已经开发了上述多种方法进行高GC含量基因的检测，但单一使用其中一种方法存在许多不足，譬如直接进行RT-PCR检测，在检测过程中会检测到许多空载体，会浪费实验资源。仅仅依靠抗性筛选和蓝白斑筛选，筛选中的菌株中会有一些假阳性菌株产生。使用蛋白质印迹法对一些在细胞内不表达的基因无法检测。为实现高GC含量基因的准确检测，若将抗性筛选、蓝白斑筛选和RT-PCR三种检测方法组合在一起，有可能实现对目的基因的精准检测。

参考文献

[1] 冯淼,王璐,田敬东. 基因合成技术研究进展[J]. 生物工程学报. 2013(08)

[2] 陈常庆,戚志红. 基因合成[J]. 遗传工程. 1983(03)

[3] 高朝辉. 基因合成方法的改进与验证[D]. 吉林大学 2008