1. 研究目的与意义（文献综述）

目的：学习掌握基于crispr-cas技术的基因敲除方法;

验证prnp基因失活后对肿瘤细胞的影响。

研究现状：crispr-cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的rna指导的降解入侵病毒或噬菌体dna的适应性免疫系统。crispr-cas9技术通过grna特异性识别含有pam的靶dna序列,cas9蛋白对靶序列进行切割,然后通过细胞dna修复机制进行修复从而实现基因组的高效编辑。crispr-cas9系统广泛应用于基因治疗、基因功能研究、建立与人类疾病相关的动物模型。crispr-cas9是目前最高效的基因组编辑系统，它基因编辑效率高、构建方法简单、可实现多基因打靶、成本偏低。

2. 研究的基本内容与方案

研究基本内容及目标：

应用crispr-cas技术敲除黑色素瘤细胞mm-mc中prnp基因。

学习并设计cripsr-cas方法，设计引物，转染癌细胞，筛选单克隆，验证prp基因的敲除。

3. 研究计划与安排

第1－2周：查阅crispr-cas技术等相关文献资料，明确研究内容，拟定试验方法和条件。确定方案，完成开题报告。

第3－11周：完成引物设计，癌细胞转染、单克隆筛选以及prnp基因敲除验证以及prnp基因失活对黑色素瘤细胞mm-mc的影响。

第12周：实验现象分析及实验数据处理。

4. 参考文献（12篇以上）

[1] overview of crispr-cas9 biology. ratner hk, sampson tr, weiss ds. cold spring harb protoc. 2016 dec 1;2016(12):pdb.top088849. doi: 10.1101/pdb.top088849.

[2] type iii crispr-cas immunity: major differences brushed aside. tamulaitis g, venclovas #268;, siksnys v. trends microbiol. 2016 oct 20. pii: s0966-842x(16)30144-5. doi: 10.1016/j.tim.2016.09.012. [epub ahead of print] review.

[3] the solution structure of an anti-crispr protein.maxwell kl, garcia b, bondy-denomy j, bona d, hidalgo-reyes y, davidson ar.nat commun. 2016 oct 11;7:13134. doi: 10.1038/ncomms13134.