ZnS,，ZnSe，ZnO 量子点的细胞毒性评价毕业论文
2020-02-19 14:34:22
摘 要
量子点(ZnS)由于其出色的光化学性能,在生命科学领域具有很重要的应用前景。锌基量子点在经过修饰后表面具有生物相容性和水溶性等优势，在多个方面都有良好的应用，比如复杂环境多组分可视化检测、活体细胞实时成像分析、疾病诊断和治疗等方面。因此，研究量子点在生物体系的毒性作用，提高生物友好性质是开发量子点在生命领域应用的基础。。本论文应用CCK-8法检测锌基量子点对PC12细胞活性的影响，评价ZnS，ZnSe，ZnO量子点的细胞毒性。
关键词：量子点，CCK-8，细胞毒性，体外模型，PC12细胞
Abstract
The main purpose of this paper is to determine the cytotoxicity of ZnS, ZnSe and ZnO quantum dots. In recent years, quantum dots (ZnS) have attracted much attention due to their excellent photochemical properties. Zinc-based quantum dots have the advantages of biocompatibility and water-solubility after modification, and have good applications in many aspects, such as multi-component visual detection in complex environment, real-time imaging analysis of living cells, disease diagnosis and treatment, etc. Therefore, the study of the toxicity of quantum dots and their effects on various cell processes in vitro is a necessary condition for understanding the interaction between quantum dots and biological systems. In this paper, CCK-8 method was used to explore the effect of zinc-based quantum dots on cell activity, and then to evaluate the biocompatibility.
Key Words： Quantum dots, CCK-8, cytotoxicity, in vitro model, PC12 cells
目 录
第1章 绪论 6
1.1 前言 6
1.2 量子点合成 7
1.2.1 水热法 7
1.2.2 溶剂热法 8
1.3 量子点应用 8
1.3.1 量子点标记技术在生物医学检测中的应用 8
1.3.2 量子点标记技术在食品安全检测中的应用 9
1.3.3 量子点电化学发光及其在生物分析中的应用 9
第2章 材料与方法 10
2.1 CCK-8法的细胞活性检测 10
2.2 细胞复苏 11
2.3 细胞的传代培养 12
2.4 细胞传板与标准曲线制定 12
2.5 细胞增殖-毒性检测 13
2.6 数据测量结果 14
第3章 数据结果分析 17
3.1 ZnS量子点的细胞毒性 22
3.2 ZnO量子点的细胞毒性 22
3.3 ZnSe量子点的细胞毒性 23
3.4 结论 23
第4章 讨论 24
4.1 量子点在生物荧光标记中的应用前景 25
4.2 量子点在纳米载药方面的应用前景 26
参考文献 27
致谢 28
第1章 绪论
1.1 前言
随着纳米材料的需求和生产持续增长，纳米技术的研究和开发在过去几年中已成为越来越流行的趋势。纳米技术是一个包含多学科研究（包括化学，物理，工程和生物技术）的研究领域，在农业，汽车，服装，国防以及最近的生物学和生物医学领域有着广泛的应用。在许多不同的纳米技术产品中，量子点（QD）因其非常特殊的物理化学和光学性质而在生物学中作为成像探针获得了广泛的普及。它们稳定，高荧光，可调，可通过表面修饰实现功能化。尽管正在进行大量关于量子点合成以改善其物理性质的研究，但是量子点的生物学效应研究很少。到目前为止，已知量子点生物相容性在很大程度上取决于它们的粒子大小，表面电荷，核心和表面材料。目前，许多科学中心正在研究关于量子点与细胞过程的相互作用（或干扰）的广泛研究。对细胞过程和分子机制的理解对于药物发现至关重要，特别是对于疾病的诊断和治疗。然而，目前在生物医学方面的发展受到缺乏可视化细胞事件和单分子信号传导工具的阻碍。 因此，纳米技术在生物医学中的整合是当前研究的热门。如高分辨率生物医学成像，从微观到纳米，从二维到时空，正在迅速发展。
上世纪70年代中期是现代量子点技术的起点。为了解决全球能源危机问题，量子点技术迅速发展了起来。通过研究，科研人员开发出半导体和液体的结合面，并利用纳米颗粒来产生能量解决能源危机。到了上世纪80年代初期，一名瑞士物理学家在合成出了硫化镉胶体，与此同时Brus博士与同事发现改变硫化镉颗粒的大小会改变其颜色。Brus博士在研究了两年硫化镉胶体后证明了改变硫化镉胶体颗粒的大小，会随之改变其激子能量。于是，他将量子点与这种胶体的概念联系起来，首次提出量子点[1]。这项研究是阐明量子限域效应的关键，这个效应对量子点大小以及颜色之间的相互关系做出了有效的解释，为量子点的应用打了新的大门。自上世纪末，量子点制备技术的不断提高，并且越来越多的应用到生物学的研究。NIE和Alivisato两位研究人员所在的团队首次阐明了量子点在荧光标记和体内示踪领域的前沿科研成果，解决了量子点作为生物探针的生物相容性和靶向性这两大重要的难题。这是量子点技术应用的一项重大的进步，在这之后更多的科研人员投入到量子点的研究中。
量子点作为生物学和医学中的成像工具具有优点也有局限性。在目前的纳米技术产品阵列中，半导体纳米晶体量子点是一种非常有前景的细胞成像工具。胶体量子点核的直径通常为2至10nm，并且通常由来自II-VI族（例如CdTe，CdSe）和III-V族（例如InP，InAs）的原子组成[2]。这些量子点核通常用附加的无机材料层或壳（例如ZnS）覆盖以增强其量子产率。根据尺寸和成分，量子点可以从不同的波长发射，从紫外到可见光到近红外（NIR）。与传统的有机荧光团不同，量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱，解决了许多传统有机荧光团的弊端。总之，不同大小的量子点可以通过单一波长同时激发并发出明显不同的颜色，允许同时标记多个物种。除了新颖独特的光学特性外，由于其无机层成分，量子点也具有高的光稳定性，使其不易受光漂白影响，并且与有机荧光染料相比，荧光寿命显着延长（10-40 ns），因此可用于长期重复成像。但是量子点并不是一种完美的工具，在应用过程中也存在许多不足。量子点在目前的生物医学研究进展中仍然存在一些限制，需要研究人员对量子点进行更加透彻的研究。例如细胞毒性、空间位阻效应、量子点的表面修饰等都是急需解决的问题。因此，选择生物相容性好、非特定吸附量小的修饰试剂对量子点表面进行修饰，使其毒性降到最低，这将是未来量子点应用领域的关键研究方向。随着研究的深入，我们相信人们将对量子点的性质以及量子点的合成与制备技术有越来越深入的了解、物医学研究中发挥越来越重要的作用。
1.2 量子点合成
常用的量子点合成方法有水热法、溶剂热法
1.2.1 水热法
水热法是直接加热有机分子前体的水溶液而得到量子点的方法，利用稳定剂如疏基小分子直接合成在水溶液中。这种方法的缺点是制得的量子点的发光效率比较低，但其优点明显，如制备工艺简便、安全性及经济性良好，并且不需要进一步表面功能化修饰以及在用于生物荧光探针时有很好的效应[3]。因此，研究人员致力于研究量子点的表面修饰和表面包覆，以及如何利用水热法合成发光效率高的量子点。水相合成法一般使用巯基化合物作常用稳定剂，这是由于铬离子与巯基具有很强的配位结合能力，可以完成在水溶液中大量合成量子点的工作[4]。目前修饰剂中巯基乙酸、巯基乙胺和巯基丙酸等有良好的效应。但是由于这些修饰剂自身具有毒性，不利于量子点在生物医学临床上面的应用，而 N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作为氨基酸，具备有生物活性，没有毒性对人体无害，因此在水热法中得到很好的研究[5]。近年来，寻求自然可持续的有机生物原材料是量子点的水热法合成的重心。
1.2.2 溶剂热法
溶剂热法加热含有机分子前体的有机溶剂而合成量子点的方法。例如以维生素C为碳源，醇和蒸馏水为溶剂，经过加热可以合成发绿色荧光的量子点。有科研人员通过加热四氯化碳和不同浓度的氨基钠，合成了可可以发射多种颜色的量子点。同时，这种量子点的量子产率达到25%。这种加热有机溶剂来合成量子点的方法溶剂热法，其操作相对简单，但由于有机溶剂大多具有毒性，在生物医学应用方面不及水热合成法。
总的来说，这两种量子点合成方法各有优缺点。寻找廉价、环保的原材料，使量子点表面被钝化，并且且易于掺入其他原子来改良量子点光化学性质的合成方法一直是人们研究的重点。寻找优良的绿色原材料使量子点合成时表面钝化非常重要，量子点在表面钝化后不仅可以提高量子产率，还能在其表面引入多种功能基团，提高量子点水溶性。
1.3量子点应用
1.3.1量子点标记技术在生物医学检测中的应用
量子点用作于生物荧光探针在生物医药中的应用是一个非常具有好的研究领域。量子点在结合生物分子后具有优良的光谱特征以及光化学稳定性，可以大范围研究利用荧光探测生物体系及其应用范围，比如做到对活细胞内部分子运动规律的监测 ，或即时观察测量供体一受体之间相互的作用[6]。自 20 世纪 80 年代起 ，生物学家已经开展了许多对量子点大量的研究，但是量子点的制备在当时是十分困难的事，而且会产出低产率的荧光量子点，所以到底应该怎样将其应用于生物学研究是几乎没有人知道的[7]，大量的工作仍然是处于基本阶段，如研究量子点的基本特性。自20世纪末 ，随着纳米科学技术的大力发展，半导体纳米粒子在生物学和临床实验室中的潜在应用价值引起了人们的广泛关注[8]，并且半导体纳米粒子逐渐的显现出优秀的科研价值和良好商业发展前景。诸如Science和Nature等国际上许多高水平的期刊杂志都多次报道了有关半导体纳米晶体的合成方法，物理化学特征以及其在生物医学领域中的应用。
量子点具有纳米光学效应、发射光谱窄、对称性好、高灵敏度、荧光强度高、光漂白速度慢等特有的光化学性质。它们在生物科学等一系列学科中的应用将成为人们越来越大量关注的焦点，有可能进一步成为一种方便实用的新类型生物荧光探针标记。量子点目前在生物医学成像也有良好的应用，在红外区发射的一些量子点被标记在组织或细胞的特定成分上，并受到红外光的刺激，从而可以通过成像检测分析组织的内部条件[9]。量子点在生物芯片研究中也有潜在的应用，利用一系列不同的量子点标记待检测的各种蛋白质，可以实现同样一波长的光激发，同时检测芯片上所有标记的蛋白质与蛋白质之间的相互作用。这将更大提高检测效率，进一步促进基因组学和蛋白质组学的研究进程[10]。
1.3.2 量子点标记技术在食品安全检测中的应用
农药残留是农药使用后一段时间内残留在生物体和收获作物上的微量农药原生质体、降解物质、有毒代谢物质和杂质的合称[11]。长期食用农药残留超过农药产品标准的食物，对人畜具备有害影响，可能造成人畜慢性中毒，严重时可导致急性中毒，甚至死亡。
将量子点应用于农药检测中可以快速、便捷和特异性检测食品中农药残留率，对人类健康是非常有必要的。目前在量子点应用于农药检测中有两种常用方法。第一种，采用亲水性基团修饰量子点表面代替疏水性基团，将油溶性的硒化镉/硫化锌量子点转移到水相中，然后用有机磷水解酶通过阴离子和阳离子结合形成生物结合物，用这种方法研制了一种新型量子点生物传感器。该生物传感器可用于对氧磷农药的检测。第二种是利用碲化镉量子点和磺化杯芳烃建立的超分子纳米光敏剂快速检测酰胺磷和乙胺嘧啶的方法，根据量子点的荧光响应特性可以将这种方法用于杀虫剂的选择性检测。
量子点的荧光特性使量子点检测方法具有灵敏度高、特异性和快速性等优点。因此，它在食品安全检测和控制中有着广泛的应用。特别是量子点的多色标记可以用来检测食品中的多种药物残留。此外，在兽医门诊中，应用量子点的荧光特性进行检测，可以同时检测多种病原体，减少诊断时间，大幅度提高诊断效率，达到更好的治疗效果。
1.3.3 量子点电化学发光及其在生物分析中的应用
量子点（QDS）是一种新型的ECL发光材料[12]。它们的发光性能与其表面状态和尺寸密切相关。空穴和电子可以注入量子点的表面或中心导带，从而产生ECL辐射。量子点的电化学发光机制与经典的电化学发光机制相似，包括自由基湮灭和共聚物参与。
量子点以其优异的物理化学性能逐渐成为生物分析领域最具竞争力的发光材料。特别是它们的尺寸控制发光行为使得量子点适合于多组分生物分析。但它们也面临着具有生物毒性、低灵敏度、非特异性结合、高工作电位等实际问题。
利用低毒生物相容性分子对量子点进行封装改性或合成低毒（或无毒）量子点（如碳量子点、石墨烯量子点、金属纳米团簇等）及其相关的ECI机制将是今后量子点ECI生物传感器研究的重点。在信号放大方面，随着纳米技术和生物技术的进一步发展，将一些新的纳米材料（如石墨烯、树状聚合物、多孔硅纳米球等）与生物放大技术（如连接酶、常温循环放大、环滚放大放大等）结合起来，对于信号的提高有很大的帮助。这将是是生物分析中QDs-ECL的一个重要趋势。结合核酸适体技术，QDs—ECL可以检测小分子、蛋白质和其他具有高选择性的生物分子。总之，QDs-ECL分析技术在食品检测、生物医学等领域的广泛应用，将推动QDs-ECL向多组分、高通量、小型化、实际化和动态监测方向的发展。
第2章 材料与方法
2.1 CCK-8法细胞活性检测
Cell Counting Kit-8是一种Dojindo所开发的细胞活性的检测方法。其主要成分为水溶性四唑盐（WST-8）。它能够在细胞中的电子载体存在于环境的情况下被还原成水溶性的甲臜染料。WST-8在被活性细胞内的脱氢酶氧化还原后生成橙黄色甲臜染料存在于培养基中，其生成的甲臜染料含量与活性细胞数量成正比。
因此CCK-8法是用于检测细胞活性的实验方法，通常用于测定细胞增殖或者毒性试验，是一种无放射性的比色检测法。
1.预实验制作标准曲线测定细胞数量与OD值的关系，在进行细胞增殖-毒性测量实验前需要根据标准曲线确定每个孔加入的细胞数量以及加入CCK-8试剂后需要的培养时间。
2. 为了减少实验96孔板蒸发带来的的误差，我们在培养板的周围一圈孔只加PBS溶液，但是不作为检测的指标。并且在接种混匀细胞悬液，在接种每个孔时使用移液管充分吹打悬液避免细胞产生沉淀使培养板中细胞数量不均匀。
3.不同种类和数量的细胞需要不同的培养时间。对于显色困难的悬浮细胞，在加入CCK-8试剂培养一段时间后可先观测染色程度。本实验中使用的细胞为PC12细胞为容易显色的贴壁细胞，在培养1小时后既可取出观测显色程度。
4.在本实验中，细胞在传代与传板过程中培养时间较长，培养液的颜色与PH会发生变化影响CCK-8试剂的反应，因此在加入CCK-8试剂时需要重新添加新鲜的培养液。
5.实验中CCK-8试剂的加入量非常微小，加入试剂时必须减少在移液枪上的残留。因此加入试剂时移液枪的枪头必须紧贴孔壁使CCK-8试剂与培养基混合均匀。操作时速度要快，并且可以摇晃培养板帮助试剂与培养基混合。
6.在原培养基中如果含有还原剂，会使CCK-8试剂被还原从而影响实验测量的OD值。因此在本实验中需要设定空白组与实验组进行对比，检测培养基中是否含有还原剂。
2.2 细胞复苏
[实验用品]
1.仪器：培养瓶、EP管、移液管、水浴箱（37℃）、培养皿、离心机
2.材料：PC12细胞
3.试剂：1640培养基（Thermo Fisher Scientifictm-8118390）、胎牛血清（life technologiestm-42F0374K）、胰酶溶液（life technologiestm-1919090）、双抗
[实验步骤]
1. 打开细胞间水浴锅，待温度升至37度。
2.在准备好的培养皿中加入8-10ml的培养液（在1640培养基中加入10%血清和1%双抗），放置于恒温箱中预热。
3. 从液氮中取出细胞，之后迅速转移到37度水浴锅中解冻细胞。解冻过程中轻轻摇动冻存管，促使细胞解冻。
3.将融化后的细胞悬液转移到1.5毫升EP管中，补充适量的培养液，避免细胞长时间存在于在高浓度的二甲基亚砜溶液中。
4. 在室温，1000 r的条件下离心5 分钟。然后丢弃上清液，用完全培养液重悬细胞沉淀，之后将细胞转移至培养皿中培养。
2.3 细胞的传代培养
[实验用品]
1.仪器：培养皿、超净工作台、倒置显微镜、EP管、移液管、水浴箱（37℃）
2.材料：PC12细胞
3.试剂：胰酶溶液（life technologiestm-1919090）、1640培养基（Thermo Fisher Scientifictm-8118390）、胎牛血清（life technologiestm-42F0374K）、双抗
[实验步骤]
1.将培养皿中的原培养液倒掉；
2.加入1毫升胰蛋白酶溶液，用移液管吹打使培养皿底部浸泡溶液。
3.加入胰蛋白酶溶液10s后，倒掉胰蛋白酶溶液，并将培养皿放入培养箱中2分钟。倒置显微镜观察细胞，在原粘附细胞变圆后加入5-6毫升培养液（在1640培养基中加入10%血清和1%双抗）终止消化。
4.将培养皿中粘附细胞用移液管吹成悬浮液，分为两个或三个培养皿。然后放入在37℃培养箱中培养。
