摘 要

阿尔兹海默症是世界瞩目的神经系统退化疾病，由于患病人数逐年增加，损耗成本逐年增大，目前针对阿尔兹海默症的研究十分热门。基于对阿尔兹海默症病理研究中认可程度最高的淀粉样蛋白级联假说，本文通过研究低浓度淀粉样蛋白对sh-sy5y细胞的蛋白质组作用情况，进而研究低浓度淀粉样蛋白在阿尔兹海默症中的作用机制与病理效果，有望对阿尔兹海默症的临床治疗和药物研发产生一点启示。实验中使用二甲基化与SILAC同位素标记与定量测量的方法，再将所得溶液进行质谱分析，得到实验数据。在后期分析过程中，蛋白质互相作用网状图可由STRING数据库分析得到，在cytoscape进一步整合得到互作网络图，发现SKIV2L2、SF3B4、NUDT21、HNRNPUL1蛋白聚集体在网络图中处于中心位置，并进行详细分析。使用Gene Ontology（GO）数据库对蛋白组进行功能信息检索，发现蛋白组主要参与了调节、代谢、免疫等生物过程，在细胞连接中的占比也较大，在细胞的信息传递、沟通调节方面发挥着举足轻重的作用。运用KEGG数据库对蛋白组在阿尔兹海默症中的反应途径与作用机制进行详细分析，β淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集与沉积使得老年斑的出现，这是阿尔兹海默症的一大重 要特征，此外还会激活神经细胞内半胱天冬酶（CASP），这将显著降低患者记忆力水平。同时随着Tau蛋白在细胞内增加，神经微管正常功能被破坏，这将导致神经纤维的异常缠绕，这是阿尔兹海默病患者的第二大特征。

本文的一大特色是在蛋白组水平上研究低浓度淀粉样蛋白对细胞的作用变化，有望对阿尔兹海默症的临床治疗和药物研发提供一点帮助。

关键词：阿尔兹海默症；淀粉样蛋白；蛋白质组学

Abstract

Alzheimer's disease is a deteriorating disease of the nervous system in the world. As the number of patients increases year by year, the cost of loss increases year by year. Currently, research on Alzheimer's disease is very popular. Based on the most recognized amyloid cascade hypothesis in the pathological study of Alzheimer's disease, this paper studies the proteome action of low concentration amyloid on sh-sy5y cells, and then studies the low concentration of amyloid in Alz. The mechanism of action and pathological effects in Haimo's disease are expected to have some implications for the clinical treatment and drug development of Alzheimer's disease. In the experiment, dimethylation and SILAC isotope labeling and quantitative measurement were used, and the obtained solution was subjected to mass spectrometry to obtain experimental data. In the post-analysis process, the protein interaction net map can be analyzed by the STRING database, and the interaction network map is further integrated in cytoscape. It is found that SKIV2L2, SF3B4, NUDT21, HNRNPUL1 protein aggregates are in the center of the network map, and detailed analysis. The Gene ontology (GO) database was used to search the functional information of the proteome. It was found that the proteome was mainly involved in biological processes such as regulation, metabolism, and immunity, and it also accounted for a large proportion in cell connection, in terms of cell information transmission and communication regulation. Play a pivotal role. The KEGG database was used to analyze the reaction pathway and mechanism of action of the proteome in Alzheimer's disease. The abnormal aggregation and deposition of amyloid β (Aβ) led to the appearance of senile plaque, which is a major disease of Alzheimer's disease. An important feature, in addition to activation of caspase in nerve cells, will significantly reduce patient memory levels. At the same time, as the Tau protein increases in the cells, the normal function of the neurotubules is destroyed, which leads to abnormal entanglement of nerve fibers, which is the second most characteristic of patients with Alzheimer's disease.

A major feature of this paper is the study of the effects of low concentrations of amyloid on cells at the proteome level, which is expected to provide some help in the clinical treatment and drug development of Alzheimer's disease.

Key Words： Alzheimer's disease.；amyloid；proteomics

目 录

第1章 绪论 1

1.1 研究背景 1

1.2 阿尔兹海默症研究现状 1

第2章 低浓度淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞的蛋白组学实验 3

2.1 研究目的 3

2.2 研究背景 3

2.3 研究方法 4

2.4 研究步骤 6

2.5 实验数据 7

2.6 数据分析 7

第3章 低浓度淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞的蛋白组学分析 9

3.1 实验结果 9

3.1.1 蛋白质互相作用分析 9

3.1.2 蛋白质功能分析 14

3.1.3 蛋白质信号通路研究 16

3.2 结论 18

参考文献 20

致谢 22

第1章 绪论

1.1 研究背景

阿尔兹海默症（Alzheimer disease，AD），民间俗称老年痴呆症，是一种晚年显露的严重神经系统退行性疾病。^[1-3]在临床上表现为，丧失记忆能力、语言表达不清、辨别能力下降、行动功能障碍以及性格行为改变的全面性痴呆，多发于70岁以上人群。目前随着生活水平以及医疗保健水平的提高，许多国家包括我国的人均预期寿命也大大提高。但随着人类寿命的普遍延长，患此病患者人数也逐年增加。^[4]考虑到照顾该疾病患者的直接成本与间接成本，对于阿尔兹海默症（AD）发病机理与防治的研究也成为了国内外关注的一大热点。经病理组织学的研究，阿尔兹海默症（AD）的主要病理特征是β淀粉样蛋白的异常沉积。由于β淀粉样蛋白是AD患者大脑中老年斑的主要成分，目前认为它可能在该病发病机制中起起始与关键作用。β淀粉样蛋白在人脑中大量生成与聚集，并沉积，会引起神经元钙稳态失衡，从而产生大量自由基，引发炎症，导致脑组织局部炎症频发等一系列反应，继而神经元与神经网络受损，出现中枢整合功能异常。^[5-7]因此，我们做出设想，降低β淀粉样蛋白在大脑中的蓄积量可以减轻或者延缓阿尔兹海默症（AD）的症状。本文就AD研究领域中的最热门内容-低浓度淀粉样蛋白对sh-sy-5y细胞的蛋白组学研究，进而探讨低浓度淀粉样蛋白在发病机制的有效性，揭示低浓度淀粉样蛋白在发病机制中的机理，为其日后作为防治病情药物应用于阿尔兹海默症提供线索与理论依据。

1.2 阿尔兹海默症研究现状

阿尔兹海默症（AD）作为国际中发病频率最高的老年疾病，每年耗资成本巨大，一直以来都备受科学家们的关注，如何寻找有效药物与方法控制病情也成为了一大热点话题。

几十年来，针对阿尔兹海默症（AD）发病机制的假说不可计数，但接受程度最深的还是淀粉样蛋白级联假说。该假说指出，导致阿尔兹海默症发病的一个重要原因便是β淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集与沉积，导致老年斑的形成与神经纤维的缠绕，进而影响神经细胞的正常代谢导致痴呆的发生。进而，许多学者提出抑制β淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集与沉积，或者降低β淀粉样蛋白（Aβ）的浓度是治疗阿尔兹海默症（AD）的突破口。这类药物也成为了国际上治疗阿尔兹海默症时最热门、最常规、发展最快的一类药物。^[8]

目前临床上有许多关于β淀粉样蛋白（Aβ）的免疫疗法用于治疗阿尔兹海默症（AD），已小有成效，为治疗该疾病提供了重要的实践基础。在这众多的免疫疗法中，最重要的两种，分别是主动免疫疗法与被动免疫疗法。^[9]

主动免疫法指的是在人体中注入特定抗原，该抗原进入人体内后可以诱导抗体的产生发生特异性免疫反应，进而消除沉积β淀粉样蛋白（Aβ），达到减缓认知能力下降等症状。目前在临床中检验有效的疫苗有AN1792疫苗、CAD106疫苗、UB-311疫苗等，但是目前这些疫苗作用效果也有限，大约有20%患者会产生抗体应答，认知能力下降速度减缓。采用主动免疫法注射疫苗的方法，一方面成本较低，适合在临床中广泛使用；且主动免疫由于会产生抗体的免疫性应答，因此能够在短时间内维持较高浓度的抗体。但是如果过高浓度的抗体聚集在β淀粉样蛋白（Aβ）斑块周围，同样容易引起斑块解聚与微细管破裂等不良反应。与此同时，由于阿尔兹海默症（AD）高发人群一般为老年人，他们的身体免疫机能有所降低，在一定程度上会影响主动免疫法的疗效。

被动免疫法指的是在人体内注入外部产生的抗体，目前在临床上广泛使用的抗体有Aducanumab、Solanezumab与Crenezumab，它们可以特异性地与β淀粉样蛋白（Aβ）聚集体的某个部位结合，达到水解Aβ聚集体的目的。但是到目前为止，还没有一个可以完全靶向Aβ聚集体的抗体表现出非常明显的疗效，还需要进一步探索。^[10]

虽然目前研究出来的药物与方法对治疗阿尔兹海默症的治疗还有限，无法找出一个完全起作用的药物与方法，但是临床上的部分成功实验也能一定程度上验证淀粉样蛋白级联假说的有效性，因此我们研究低浓度淀粉样蛋白对SH-SY5Y 细胞的蛋白质组变化也更加有意义。

第2章 低浓度淀粉样蛋白对SH-SY5Y的蛋白组学实验

2.1 研究目的

通过构建SH-SY5Y细胞模型，研究不同浓度下的低浓度淀粉样蛋白对其内部结构以及蛋白质表达的影响情况。运用二甲基化标记与SILAC（稳定同位素标记氨基酸进行细胞培养）标记的同位素标记法对SH-SY5Y细胞进行标记，并选取低浓度的淀粉样蛋白溶液诱导处理SH-SY5Y（人骨髓神经母细胞瘤细胞），收集蛋白组数据并运用数据库进行信息检索与分析，可以有效探讨低浓度淀粉样蛋白对已标记的SH-SY5Y细胞的影响情况，通过蛋白组学分析可研究蛋白质之间的相互作用以及作用机制，有望对阿尔兹海默症的临床研究提供一定的帮助，为临床研制抗病药物提供新思路。

2.2 研究背景

β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）的前体物质是β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP），是经APP水解产生的多肽，沉淀聚集于细胞质基质后会有强神经毒性。它可由多种细胞分泌而成，广泛分布在血液，脑脊液以及脑间质液中，一般的β 淀粉样蛋白都和伴侣蛋白分子结合在一起，其余的呈游离状态。阿尔兹海默症（AD）患者中老年斑的主要成分就是β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ），在一般情况下β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）可以通过合成与产生维持平衡，但是在AD患者脑部细胞中β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）逐渐由可溶解状态向不可溶解状态转变，进一步形成了大量的沉积与聚集。β 淀粉样蛋白（ amyloid-β，Aβ） 发生沉积时，不但会引起神经细胞的退行性病变，而且还会导致血脑屏障的损坏，它是引发阿尔兹海默症病人大脑中老年斑周围神经元变性以及死亡的重要因素。

β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ） 神经毒性作用的发现堪称阿尔兹海默病进程中的一大里程碑。早在1991年，Kowall等人在老鼠以及猴的大脑皮质中注入β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ），他们惊讶地发现，注射过的位置出现了组织坏死，周围神经元损失的情况，且这些恶化情况与注入计量存在着直接的相关性。^[11]β 淀粉样蛋白（ amyloid-β，Aβ）的沉积与聚集可以直接损害血管，使之硬化，失去弹性，更严重的情况还会让血管破裂，形成血栓，这是β 淀粉样蛋白（ amyloid-β，Aβ） 对神经系统毒性作用的重要机制。在衰老的哺乳动物大脑中，我们显著地发现沉积的β 淀粉样蛋白（ amyloid-β，Aβ）会引起神经元变性以及神经突出短缩，这与阿尔兹海默症发病情形十分相似。

SH-SY5Y细胞中文名为人骨髓神经母细胞瘤细胞，它由人的神经母细胞瘤细胞系SK2N 2SH 衍生而来，具有神经突样的细胞质突起。它具有很多神经元在生化以及功能上的特点，因此也被广泛地用作神经细胞的模型，可以广泛用于神经细胞的分化、代谢、变性的过程的研究，对于研究与探讨神经系统疾病的发病原理以及寻找相关有效药物具有十分重要的意义。

蛋白质的不同空间结构与相互作用与生命活动息息相关，研究蛋白质的表达形式对于病理、生理过程十分重要。考虑到β 淀粉样蛋白（ amyloid-β，Aβ） 的应用过于广泛，产生作用的机制与反应通路也不可计数，要发现低浓度淀粉样蛋白对于SH-SY5Y细胞的作用也存在一定的难度。因此我们使用蛋白组学研究，可以有效探明不同浓度淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞的影响程度以及其作用机制与反应通路。“蛋白质组（proteome）”也就是在单个细胞，组织或者一个发育完善的个体中存在的完整的一套蛋白质。不同于一般的单个蛋白质分析，由于在个体中基因组的表达情况瞬息万变，它研究的是一个动态变化着的整体。蛋白质组学则主要是研究蛋白质组，可以通过在蛋白质水平上察觉到各个蛋白质的表达状况、翻译与修饰、相互作用等等内容，进而动态描述细胞中基因表达的所有蛋白质，这对于在蛋白质水平上全面了解细胞代谢过程与发病机制有着重要的帮助。目前已经可以通过对各细胞或者组织中基因表达的蛋白质组学研究，进一步深入测量不同时期细胞内蛋白质组变化，用于检测疾病的致病机制以及适用药物的作用途径，对于人类疾病的治疗具有非凡的意义。我们在本实验中使用蛋白质组学的方法，可以有效直观地揭示低浓度淀粉样蛋白的反应机理与作用机制，对于临床上研究阿尔兹海默症的治疗药物带来新的思路，有望进一步攻克阿尔兹海默症这一全球性难题。

2.3 研究方法

常见的蛋白质组学实验通常分为三个步骤，第一步是进行细胞中蛋白质的提取与分离，第二步是用质谱等方法获得足够的信息用于鉴定蛋白质结构，第三步是对数据进行整合检索并进行结果分析。我们选用的是定量蛋白组研究策略，定量地鉴定可以更好体现蛋白质的功能，分析更加全面，体现综合性的研究原则。

常规方法中，系统全面地完成对细胞中蛋白质的定量比较与定性分析，通常有三种方法：

（1） 对于没有分离的混合物中蛋白质，一般进行快速鉴定，如使用自动化串联质谱以及序列数据库检索等方法。

（2） 对于不同样品中含量不同的蛋白质，一般运用稳定同位素稀释方法。

（3） 对于需要筛选出的特定肽类物质，一般选择特定的化学反应从复杂的肽类化合物中分离出来。

本次试验完成蛋白质定量分析选用特异性标记与MS进行，首先需要用稳定的同位素在氨基酸或者肽分子做标记，本实验中选用的是二甲基化标记与稳定同位素标记氨基酸进行细胞培养的方法（stable-isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC），再对标记好的片段进行MS或MSX，这时可用于进行定量分析，这是因为它会产生特别的质谱信号所致。

二甲基化标记一般是针对伯胺基团起作用的，由于它成本较低，操作方便，标记速度快，结果稳定可靠已经被广泛应用于“自下而上”蛋白质组学中。“自下而上”研究策略即先用蛋白酶将完整的蛋白质分解为小分子肽之后再进行分析，主要是在多肽水平上进行的。

SILAC主要运用于人，狗，兔子等高等动物中蛋白质的定量测量，属于体内标记法的一种。^[12]在含有稳定同位素（N13、C13）的培养液中培养多组细胞，经过5-6代培养后，可以有效标记处细胞内新生成的蛋白质。此时，收取被标记过的同位素蛋白质样品，进行后续实验操作，分离、酶切等后，再用MSX通过质谱图中同位素峰度强度定量分析蛋白质。这类标记方法中，两组细胞（标记组与未标记组）除了标记部位，其他地方的活性基本相同，不损伤其化学性质；标记效果非常好，几乎可以覆盖全部细胞，且被标记后的细胞与原来形状几乎不变；分析简单方便，只需运用MSX即可完成操作；只适用于细胞分析，对于组织和体液是失效的；同时它的成本较高。

本实验中先按比例混合好各个被标记的酶解样品，包括牛血清蛋白（BSA）、人类蛋白质组标准样品UPS1（等浓度混合的48种蛋白质）、人类蛋白质组标准样品UPS2（不同浓度混合的48种蛋白质）、人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y。之后用胰蛋白酶将各个样本液酶解，再运用二标二甲基化标记（轻标：（CH2）2、重标：（CD2）2）与二标的SILAC（重标：含有 13C 标记的赖氨酸和精氨酸）制备同位素标记样品，再经过MSX的质谱分型，可以准确地完成蛋白质组的定量分析。其中数据分析是用的是Mascot和skyline。这种建立起来的新的基于同位素碎片离子定量方法，可以有效体现定量的可行性与优势所在。

以上是毕业论文大纲或资料介绍，该课题完整毕业论文、开题报告、任务书、程序设计、图纸设计等资料请添加微信获取，微信号：bysjorg。

相关图片展示：