摘 要

Clostridium autoethanogenum是一种可以利用CO、CO₂、H₂作为能量来源生产乙醇的优良菌株，它的主要产物为乙酸和乙醇，并可以相互转变。一般而言乙酸的产量高于乙醇，这是因为乙酸的产生更有利于能量的积累，但是pH的改变将会改变代谢过程中的碳分布。本课题研究在发酵罐系统中，将培养基pH由高向低改变，对C. autoethanogenum乙醇产量的影响。研究发现，高pH可以促进菌体生物量的积累，同时乙醇产量最高提升了1.75倍，而低pH则会促进乙酸的生成。

关键词：Clostridium autoethanogenum 合成气发酵 pH 乙酸转化 乙醇

Abstract

Clostridium autoethanogenum is an excellent strain that can produce ethanol from CO, CO₂ and H₂. Its main products are acetic acid and ethanol, and can be converted into each other. In general, the yield of acetic acid is higher than that of ethanol because the production of acetic acid is more conducive to the accumulation of energy. But the change in pH will change the carbon distribution in the metabolic process. This study investigated the effect of changing the pH of the medium from high to low on the ethanol production of C. autoethanogenum in the fermenter system. The study found that high pH can promote the accumulation of bacterial biomass, while ethanol production increased by 1.75 times, while low pH promoted the formation of acetic acid.

Key Words：Clostridium autoethanogenum Synthesis gas fermentation pH Ethanol Acetic acid conversion

目录

第1章 绪论 1

1.1研究背景 1

1.2 工业化乙醇的生产 1

1.3 Clostridium autoethanogenum 代谢途径 2

1.4 Clostridium autoethanogenum研究现状 4

1.4.1 培养条件方面 4

1.4.2 基因系统方面 6

1.5 本实验研究内容及目的意义 7

第2章 实验材料及方法 9

2.1 菌株培养及培养基配制 9

2.2 分析设备及条件 9

2.3 实验内容 9

2.3.1 菌种活化及自适应性进化 9

2.3.2 探究在发酵罐中pH对产乙酸乙醇的影响 10

第3章 结果与讨论 11

第4章 思考与建议 16

参考文献： 17

致 谢 19

第1章 绪论

1.1研究背景

石油作为化石能源的一员，如今已经成为世界上举足轻重的战略物资，在各行各业均存在着它的身影，可以说它支撑着如今的人类文明。但石油作为不可在生能源，终会有消耗殆尽的一天，在人找到其替代物之前，我们能做的只有尽量减少其的使用，在某些方面找到它的替代物，减缓石油压力。交通运输燃料是消耗石油“大户”，近几年各大能源消费国都不约而同地选择燃料乙醇作为主要的替代物，目前世界上使用乙醇汽油最多的国家是美国、巴西等国，而我国发展较晚但发展极其迅速。燃料乙醇一般来说是按一定比例与汽油混合，它并不是简单的石油替代物，添加燃料乙醇的燃料品质更加优良，它有着高辛烷值。所以燃料乙醇的添加不仅提高燃油的品质，更是缓解了石油能源压力，有着诸多益处。但是就目前而言，乙醇供不应求，各行各业对于乙醇的需求远远高于目前乙醇的产量，所以发展新型产乙醇方法或提高乙醇产量非常重要。

1.2 工业化乙醇的生产

乙醇在化学上是一种重要的试剂，它的用途广泛，可以用于食品、服装、能源方面，世界乙醇的66%用于燃料方面，14%用于食品方面，其余20%用于工业方面。近几年来，乙醇用于燃油作为清洁燃料的用途越来越得到人们的重视，乙醇用于运输工具燃料方面将会随着时间的流逝越来越多，对于乙醇的需求也随之越来越大。

传统工业化生产乙醇的方法主要分为两种:

一、化学法制乙醇，简单来说就是将乙烯在高温高压外加催化剂的情况下，直接与水反应制得。因为所用乙烯可大量来自石油裂解，成本低产量大，而且可节约大量粮食，所以发展非常迅速。但是一方面化石能源有限，我们不可能无限制的消耗，另一方面反应副产物中的异构高碳醇对人体有害。用化学法制醇不是长久之计。

二、生物法制乙醇，无污染可再生，是一种清洁的乙醇生产方式。传统生物发酵法消耗粮食十分严重，针对此种状况，有人使用非粮食经济作物比如甘蔗甜菜等作为发酵原料^[1]，巴西在这一方面走在了世界前列，但是问题也随之出现：甘蔗为巴西生产乙醇的主要原料，会给巴西政府及个人带来巨大的利益，在巨大利益的推动下开始大面积种植甘蔗，近几年的数据调查显示，甘蔗正在侵占粮食、农牧业等的土地，造成了农业畜牧业的损失，危害渐显。我国为人口大国，土地及耕地面积平均相对较少，使用非粮食经济作物为原料在我国发展仍受限；还有人将生物质使用化学或生物方法糖化处理，利用其中的糖进行发酵产乙醇，但有60%左右无法转化为产物。针对目前状况，发展新型制乙醇技术势在必行。近年，利用合成气经过厌氧发酵生产乙醇的技术较为火热，潜力较大，微生物利用CO、CO₂、H₂在厌氧条件下产生乙酰辅酶A，进而生成乙醇。Clostridium autoethanogenum 便是此类菌的代表。

CO、CO₂、H₂的来源非常广泛，某些工厂例如炼钢厂等所排出的工业废气便含有残余的此类气体，而且农作物残留物、城镇垃圾、废弃木料等含有丰富的生物质，可经过特定的技术手段处理转化为合成气，含有大量CO、CO₂、H₂等气体，一方面降低了气体成本，另一方面将废弃物重新利用减少了对环境的污染，而且通过生物同化作用产生的有机产品还可以再利用。事实上，总部位于芝加哥的LanzaTech公司已经使用钢厂废气（CO，CO₂和H₂的混合物）以商业规模从C. autoethanogenum生产乙醇和2,3-BD。LanzaTech还获得了许多相关工业和生物技术的知识产权。

1.3 Clostridium autoethanogenum 代谢途径

C. autoethanogenum 是革兰氏阳性菌，是一种严格厌氧菌，它是以CO为唯一碳源从兔粪中富集分离得到的。其可以用的碳源及能源物质有CO、CO₂ H₂、木糖、果糖 、丙酮酸等，其中以CO、CO₂ 、H₂最为吸引人，很多工厂排出的废气中均含有CO、CO₂、H₂，而这些可以作为此种菌的能源物质，转换为醇或酸，既可以减少废气中的碳排放，又可提供一条可行的产醇途径。

C. autoethanogenum ^[2]可以生长在纯CO、H₂ CO₂或三者的混合气中，其代谢途径为Wood–Ljungdahl途径,主要产物是乙醇和乙酸，乳酸和2,3-丁二醇是其副产物。与其相类似的菌还有Clostridium ljungdahlii和Clostridium ragsdalei等。

Wood–Ljungdahl途径的最核心物质为乙酰辅酶A（乙酰CoA），乙酰CoA在一列酶的催化下转化为磷酸化乙酰（乙酸途径）、乙醛（乙醇途径）、丙酮酸盐（乳酸、2,3-丁二醇途径）。CO、H₂、CO₂在Wood–Ljungdahl途径中发挥着不同的作用，它们功能有异，但同时又有重叠之处。CO在CO脱氢酶作用下转化为CO₂同时放出铁氧还蛋白（Fd_red），CO₂的主要功能有两个，一个是甲基支链-CO₂在2个[H]及HytA-E/FdhA催化下转化为甲酸盐，另一个是羧基支链- CO₂结合Fd_red转化为[CO]，[CO]与甲酸盐提供的[-CH₃]在酶催化下合成乙酰CoA继而转化为其他物质。H₂在途径中的主要作用是提供NADPH、质子和Fd_red。

在C. autoethanogenum第一个酶学研究集中于从CO中产生的氧化还原酶^[3]。最突出的发现就是一种酶复合物，由电子分叉的NADP依赖性[FeFe]—氢化酶（HytA-E）和甲酸脱氢酶（FdhA）组成，在体外表现出可逆的氢化酶、甲酸脱氢酶和甲酸氢裂解酶活性。在细菌体内该复合物被检测出只有一个氢化酶亚基具有活性，即HytA。“电子分叉”指的是在酶催化下通过与氧化还原反应偶联驱动放能的电子转移。因此，该复合物催化Wood–Ljungdahl途径的碳固定（从CO₂到甲酸盐），同时还提供利用氢作为能源的手段。还有两种酶对细菌生长代谢至关重要：Rnf和Nfn。Rnf可催化Fd_red和NAD 分别向Fd_ox和NADH转变，同时促进H 的外流，提高细胞内外质子浓度差。研究发现Rnf复合物在自养条件下高度表达，但在异养条件下完全不存在，与通过维持质子梯度（ΔμH）在厌氧条件下ATP生成的假设一致。而Nfn则催化NADH Fd_red和NADPH Fd_ox的相互转变，NADH和NADPH参与乙醇的合成，Nfn酶的存在可以促进两者之间的稳定。

图1.1 Wood–Ljungdahl代谢途径

CODH，一氧化碳脱氢酶；HytA-E/FdhA, NADP 依赖性氢化酶/甲酸脱氢酶复合物；ACS/CODH，乙酰辅酶A合酶/ CO脱氢酶复合物；Pta，磷酸转乙酰酶；Ack，醋酸激酶；AFOR，乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶；ADHE，双功能乙醛/乙醇脱氢酶；PFOR，丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶；ALS，乙酰乳酸合成酶；BudA，乙酰乳酸脱羧酶；BDH，丁二醇脱氢酶；Fdred ,铁氧还蛋白.

纵观代谢途径，其中NADPH、NADH和Fd_red是产乙醇的关键物质，在自然状态下这些物质的增多会导致醇的增多。Marcellin等^[4]提供了对自产乙醇梭菌代谢的系统级描述，包括转录组学，蛋白质组学和代谢组学数据。作者对气体（CO、CO₂、H₂）和果糖生长下的代谢行为进行了对比。代谢组学数据分析显示，在自养生长期间，细胞内NAD 浓度远远超过异养生长，而NADH浓度在生长条件之间保持恒定。此外，文章中报道的高NAD / NADH浓度比可能有助于驱动Rnf在自养营养下的正向反应，使更多H 外流，从而促进ATP的生成。Fd_red不仅是合成乙酰CoA的关键物质，同时也参与者乙酸转化为乙醇的代谢，Fd_red对于维持C. autoethanogenum代谢和能量稳定至关重要。

1.4 Clostridium autoethanogenum研究现状

近几年有关C. autoethanogenum的文献（图1.2）越来越多，人们关注它的最主要原因是其利用合成气产乙醇的能力。在野生型状态下其产乙醇是最高的，同时也是最为稳定的菌株，是一种潜力巨大的菌株。为了提高乙醇的产量，研究人员主要在两个方面对C. autoethanogenum 进行改进：培养条件和基因系统。

图1.2^[5] C. autoethanogenum的文献发展

1.4.1 培养条件方面

在改进培养条件方面，有人通过改变以下四种条件在一氧化碳中对产乙醇乙酸进行研究：初始pH值，初始总压力，半胱氨酸盐酸盐浓度和酵母提取物的浓度^[6]。结果表明，增加初始pH和较高的YE浓度对乙醇产生具有负面影响，而增加初始压力和半胱氨酸-HCl浓度具有积极作用。这些发酵结果与一些其他CO生物转化研究中观察到的趋势一致，在初始pH从5.75降至4.75，酵母提取物浓度从1.6g/l降到0.6g/l时，获得乙醇产量提升一倍，较低的初始pH和酵母提取物的浓度能够提高乙醇的产量。高酵母提取物浓度可促进生物量的积累，可是少量生物量的增加并不能促进乙醇的积累，但依靠细胞循环不断积累生物量可以极大的促进乙醇的积累，在560h后可达到48g/l。气体生物转化的一个潜在瓶颈是由于CO等气体是微溶，导致了传质限制。因此，克服这种限制的一种方法是增加压力。在分批发酵中，不同的CO压力意味着不同的气态底物浓度，其与代谢物产生和细胞密度成正比，并且添加半胱氨酸盐酸盐等还原剂，会向培养基中提供更多电子，将微生物代谢转向溶剂生成，提高乙醇产量。郭颖等^[7]在培养基中添加玉米浆来促进乙醇的生产，添加少量（0.075g/l）时乙醇产量最高并且高于正常状态。培养基中加入低浓度的乙酸也会促进乙醇的生成，但是高浓度（5g/l）的乙酸会开始抑制乙醇的生成，因此提高细菌醇的耐受性可能会提高乙醇产量。

在气体发酵中，气液的传质速率对菌体利用气体起着至关重要的作用。通气时使用中空纤维膜能更好的分散气体，增加气液传质速率，从而提高乙醇产量。但是微小的气泡往往会在培养基中产生聚结现象，降低效果，为避免微小气泡的聚结，可以在培养基中加入纳米粒子、表面活性剂、盐溶液等。盐容易在液相（即培养基）中电离成阳离子和阴离子，并且离子显示在气泡周围形成致密的电双层，导致气泡之间的强烈排斥，减少气体聚结。在气泡附近形成的致密电层，抑制了气泡聚结，并增加了传质面积，CO气流分成微气泡，然后微泡沿着液体流动稳定地移动而不经历气泡聚结，最后微泡在整个溶液中分布，以此促进细菌对气体的利用。SeopChang等的研究^[8]目的在于探究NaCl、NH₄Cl、CaCl₂、K₂HPO₄和MgSO₄，五种电解质在CO发酵过程中对气液传质速率及乙醇产量的影响，他们采用的便是中空纤维膜分散气流的方法。添加K₂HPO₄和CaCl₂对于CO的KLa值增加在3%以内，而NaCl更是降低了溶液的KLa值。在MgSO₄含量为1%时，乙酸较对照下降35%，而乙醇较对照升高13%。在进行100L合成气发酵罐的动力学模拟以预测稳态乙醇产量时，在含1% MgSO₄电解质条件下，与没有电解质的生物质生产率相比，生物质生产率提高了30％，乙醇含量也达到了20.5 g/l，存在大幅提升。经五种电解质及不同含量的试验，发现在使用中空纤维膜分散气体的系统中，含1% 的MgSO₄时产乙醇效果最好。

生物炭可释放碱（如Na和K）和碱元素（如Ca和Mg）^[9]，以及液体介质中的痕量金属，如Fe，Mn，Zn和Ni^[10]。浸出的碱和碱性化合物可能有助于缓解酸胁迫，否则会抑制厌氧消化过程中微生物的生长和代谢功能。从发酵培养基中的生物炭释放的矿物质和金属可以作为细胞生长和乙醇生产的营养物，并减少昂贵的纯化学品用于培养基配方。Hasan K. Atiyeh等探究了四种生物炭对细菌乙醇产量的影响^[11]：柳枝稷（SGBC）、饲料高粱（FSBC）、红雪松（RCBC）、家禽粪便（PLBC）与酵母提取物与（YE）进行对比。结果显示，与含有YE的培养基相比，含有RCBC和PLBC的培养基能够促进乙醇产量的提高，分别提高了16.3％和58.9％。但是在含有SGBC和FSBC的培养基中未出现乙醇产量增加的现象。而且在含有PLBC的培养基中生长的菌较普通培养基而言消耗了更多的气体，分别为69％的H₂和40％的CO，检测其离子浓度时发现PLBC培养基有着最高释放的Na，K，Ca，Mg，S和P等元素。生物炭可以持续性的释放一些离子，并且含有某些现在人为无法了解透彻的物质，各种生物炭的添加使替代酵母提取物成为可能。

痕量金属离子对于Clostridium菌属产物有重要影响Ni，Zn和W等金属对细菌刺激乙酸和乙醇的生长和生产至关重要。同样的研究还报道，Se含量从基础值增加10倍，仅刺激乙醇生产。Jyotisna Saxena等^[12]研究Co² ，Cu² ，Mn² ，Mo⁶ ，Ni² ，Zn² ，SeO₄^–和WO₄^–等痕量金属离子对于乙醇产量的影响。Ni² 可以通过促进一氧化碳脱氢酶和氢化酶来促进细菌生长，SeO₄^–和WO₄^–能够促进甲酸脱氢酶来促进碳固定，从而促进乙醇产生。Zn² 并未引起任何上述蛋白活性改变，但它可促进菌的生长与乙醇生产，原因仍需探究。Cu² 会抑制乙醇的产生，但抑制效果较为轻微。当在培养基中移除Fe² 时上述蛋白活性均下降且几近为零，由此看出Fe² 是关键离子，在代谢途径中起着非常重要的作用，这从侧面证明了铁氧还蛋白（Fd_red）在代谢途径中的重要程度。

C. ragsdalei与C. autoethanogenum同相比，为同一种属，二者代谢途径都是Wood–Ljungdahl途径，生物炭与痕量金属离子虽然是在C. ragsdalei中验证对菌的生长和乙醇的产生有重要影响，但是我相信在C. autoethanogenum中也会有类似的效果，只等待人们去探究具体影响程度如何。

1.4.2 基因系统方面

基因系统是提高乙醇产量最直接的途径。气体发酵中细菌利用溶解于溶液中的气体的速率决定着气体的利用效率，也就是在单位时间内可以固定更多的气体。CODH是细菌将CO转化为CO₂的关键酶，但在C. autoethanogenum中存在3种拷贝基因（acsA、cooS1、cooS2），Nigel P. Minton等^[13]观察通过敲除不同基因对其生长及产物的影响。经试验验证：cooS1是一种在CO氧化方向上有活性的单官能一氧化碳脱氢酶；cooS2是cooS1的同工酶；acsA编码由CODH和Acs形成的复合物，其中CO₂的还原与乙酰-CoA的产生相关。（I）在acsAKO菌株中，发现其在以CO为唯一碳源及能量来源的培养中表现为不生长，但在含有果糖的培养基中表现为生长，乙酸的产量非常低，acsA的敲除导致从果糖来的碳重新分布生成了较多的乙醇、2,3-丁二醇和乳酸。（II）cooS1KO菌株，在纯CO氛围中培养表现为更长的生长滞后期，乙酸产量减少；但在H2、CO2氛围中没有明显的滞后期，而且其生物量是野生型的2倍。（III）在cooS2KO菌株中，以CO为唯一碳源并不会影响其生长，但其最终OD值会有所降低；在H₂、CO₂中生长显示与野生型没有太大区别。所以acsA基因在菌体利用气体代谢中发挥无可替代的作用，是关键基因；而cooS1可能会对菌体利用H₂、CO₂生长产生抑制作用，但cooS1的存在可能会促进乙醇的生成；cooS2几乎很少参与对C. autoethanogenum的自养作用。

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