摘 要

本文初步研究了植物光反应系统清除甲醛作用的可能机制，以低浓度的尿素和低浓度的十二烷基硫酸钠溶液处理包埋固定的光反应酶系统，以及用二巯基丙醇抑制光电子传递链中细胞色素b6f复合物，比较处理前后酶系统清除甲醛效果的变化。

结果表明：固定化的光合酶系统经0.01mol/L的尿素和0.01mol/L的SDS处理后对甲醛的清除效果均为70%左右，相比未经处理的固定化光合酶对于甲醛的清除效果为90%左右，这可能意味着光合酶系统对甲醛的清除作用需要完整的光电子传递系统，即甲醛的氧化分解可能在放氧复合体上进行。以二巯基丙醇处理后的酶体系对于甲醛的处理效果也出现下降，这可能是电子传递链在细胞色素b6f复合物处被阻断影响了光和系统二复合体处理甲醛的能力，也可能是PSⅠ失去电子供体而受到影响，无法对甲醛分子进行处理。

关键词：固定化光合酶；放氧复合体；清除甲醛；作用机制

Abstract

In this paper, the possible mechanism of the removal of formaldehyde by plant photoreaction system was studied. The immobilized photoreactive enzyme system was treated with low concentration of urea and low concentration sodium lauryl sulfate solution, and photoelectron transfer was inhibited by dimercaptopropanol. The cytochrome b6f complex in the chain was compared with the effect of the enzyme system to remove formaldehyde before and after treatment.

The results showed that the removal efficiency of formaldehyde by the immobilized photosynthetic enzyme system after treatment with 0.01 mol/L urea and 0.01 mol/L SDS was about 70%, compared with the removal of formaldehyde by untreated immobilized photosynthetic enzyme. The effect is about 90%, which may mean that the photosynthetic enzyme system's scavenging effect on formaldehyde requires a complete photoelectron delivery system, ie the oxidative decomposition of formaldehyde may be carried out on the oxygen-releasing complex. The effect of the enzyme system treated with dimercaptopropanol on formaldehyde is also decreased. This may be because the electron transport chain is blocked at the cytochrome b6f complex, which affects the ability of the light and system II complex to treat formaldehyde. It is because PSI loses its electron donor and is affected, and it cannot process formaldehyde molecules.

Key words:Immobilized photosynthetic enzyme; oxygen-releasing complex; scavenging formaldehyde; mechanism of action

目 录

第一章 绪论 1

1.1 甲醛污染对于健康的危害 1

1.2 甲醛污染的治理措施 1

1.3植物的光反应系统的组成与功能 2

1.3.1 光反应系统的组成 2

1.3.2 光反应系统的氧化还原能力 2

1.4相关研究现状及探索目的 4

1.4.1 现阶段植物光合酶体系的研究现状 4

1.4.2 本课题的探索目的与意义 4

第二章 植物光合酶体系的提取与制备 5

2.1实验试剂与器材 5

2.2实验方法 6

2.2.1 光合酶体系的制备 6

2.2.2 光合酶的含量检测 6

2.2.3 光合酶的固定化 6

2.2.4 光合酶活力检测 7

2.3实验结果分析与讨论 7

第三章 酶体系处理甲醛的作用机制探究 9

3.1 实验仪器与试剂 9

3.2 实验方法 11

3.2.1 甲醛含量的测定 11

3.2.2 固定化光合酶去除甲醛效果观察 11

3.2.3 酶清除甲醛作用机制的探索 12

3.2.4 SDS溶液处理后上清液与沉淀的蛋白质电泳分析 12

3.3结果分析与讨论 13

3.3.1酚试剂法测定效果分析 13

3.3.2 氢键网络与水通道对酶体系处理甲醛的作用 14

3.3.3 放氧复合体对酶体系处理甲醛的作用 15

3.3.4 电子传递链阻断对酶体系处理甲醛的影响 15

第四章 总结与展望 17

4.1 甲醛若作为电子供体的作用机制 17

4.2 甲醛若作为电子受体的作用机制 17

4.3 对光合酶研究方向的展望 17

参考文献 19

致谢 21

第一章 绪论

科技的发展体现在生活实际的方方面面，为人们带来方便快捷与舒适享受的同时也会产生新的问题与矛盾。生活中不容忽视的空气污染问题充斥在我们的居所、交通、厂房、写字楼等各种活动空间，很多生产生活中应用的材料特别是经化学加工的材料和用品都可释放对人体健康有害的有机小分子，而甲醛分子正是其中的一种重要污染物。普遍应用的建筑材料、家具板材、合成纺织品以及黏合剂涂料特别是脲醛树脂均是日常生活中的甲醛污染之源^[1]，从而导致了这个污染问题在社会生产生活中的普遍存在性与重度危害性。

1.1 甲醛污染对于健康的危害

甲醛污染对于健康的危害主要集中在以下几个方面：第一个最为直接的就是其产生的刺激作用^[2]，会对皮肤黏膜造成很大的影响，且作为一种原浆毒物质，甲醛能与蛋白质结合从而产生水肿和头疼等刺激反应；其二，甲醛的致敏作用^[3]可引起过敏性皮炎、支气管炎、色斑等许多问题，对于孕妇及胎儿的危害尤为重大，需对其有重点关注。其三，高浓度的甲醛可以被认为是一种基因毒性物质，可产生致突变作用^[4]，对生命健康产生不可逆转的危害，如近期报道的两岁幼童因室内甲醛超标而患白血病后去世的事例。生活中被甲醛污染所影响的直观表现体现为头疼、乏力、胸闷等不适现象，一经发现就需要对周遭环境进行排查确认，再对其进行正确处理。

1.2 甲醛污染的治理措施

针对甲醛污染的治理方法有许多，大致包括以下几种：

(1)自然消除法：这是最为简单直接的办法，亦可称之为通风法^[5]，通过空气的流动，将有害气体排出到室外，但由于甲醛释放周期长，此法耗费时间较长，难以达到人们的要求。

(2)普通吸附法：生活中较为普遍认识的方法类如将水、醋、红茶等置于水盆中来对甲醛进行溶解去除^[6]，虽然甲醛易溶于水、醇和醚，但这种方法的弱点在于盆面的面积即与甲醛的接触面积有限，实际的去除效果也不会很理想，仍会有残留的污染物。

(3)物理吸附法：相比而言，采用活性炭吸附的方法较之前的一个与甲醛污染的接触面积大上许多倍，但这种方法也存在很大的缺陷。活性炭的内部孔隙与甲醛分子的大小存在差异，会大大的限制活性炭对于甲醛分子的吸附能力，仅能在使用初期借助活性炭内部孔隙的吸附势对一定量的甲醛分子进行吸附^[7]，从而有一定的处理效果，但在后期对甲醛的吸附能力就不会那么明显了。

(4)化学消除法及化学吸收法:通过化学反应的方法可以将甲醛氧化成甲酸或还原成甲醇，利用此类原理生产的甲醛清除剂也是处理方法之一^[8]，亦可以用酚类物质等对甲醛进行吸收，但这两种方法同时也会造成其他的负面影响，例如清除剂对家具板材的损伤，清除剂本身对人体健康的影响，产物并不能完全氧化等等问题都是不容忽视的。

(5)光触媒降解法：光触媒法去除甲醛也是一种较为好的治理方法，在光的照射下光触媒介质会产生类似植物光合作用的光催化反应^[9]，产生氧化能力极强的自由羟基和活性氧，可以氧化分解许多有机化合物和部分无机物，自然对甲醛分子的清除能力也是比较强的。但光触媒需要紫外线的激发才能发挥作用，在实际应用范围上就缩小了一部分，算是一个小小的缺点。

(6)生物法：生物膜及生物酶催化降解法对于甲醛的去除作用有其独到的优点，良好的生物相容性^[10]使其在选择阶段就容易脱颖而出，并且从酶分子作用的条件与效果这两个方面来说，生物酶在这个领域的应用前景是十分广阔的。但仍需解决酶分子变性失活的问题以及在应用中的循环性问题等难题，才能将这项技术与方法进行普及化应用。

1.3植物的光反应系统的组成与功能

植物的光合反应酶体系正是一种可以应用于甲醛的催化降解的生物酶，本次设计将菠菜中的光合酶系提取出来后借助海藻酸钠水凝胶进行固定化，并对其降解甲醛的作用机制进行探究，以确定可能的关键反应组分。

1.3.1 光反应系统的组成

根据植物光合作用组分的组成与结构，在光反应部分存在氧化能力较强的放氧复合物，同时电子传递链中的组分也有一定的氧化能力。放氧复合体是光反应光解水的场所，为类囊体腔一侧的一条33kD的多肽——锰稳定蛋白与锰簇，钙离子，氯离子共同组成的复合体^[10]，将水分子氧化成氧气同时释放出质子，电子以及氢离子，与放氧复合体相接的为PSⅡ,由反应中心P680与捕光复合体2构成，这个蛋白复合体由8个叶绿素a与6个叶绿素b以及4个类胡萝卜素分子共同构成，其主要的功能就是捕捉光电子并将能量传递给PSⅡ中的P680中心，从而使电子传递体质体醌得到水分子中提供的电子^[11]。紧接的细胞色素b6f复合物将质体醌中的电子转移到质体蓝素中，在这个过程中也有可能将甲醛催化氧化，所以也需考虑其作为关键组分的可能性。随后的组成结构即为光合系统1，质体蓝素将在这里经过光和催化最终将电子转移给氧化型辅酶Ⅱ，后者将在酶的作用下转化为还原型辅酶二并参与到暗反应中^[12]。

1.3.2 光反应系统的氧化还原能力

在整个光合作用的电子传递链中，电子从放氧复合体处产生后就会在一系列的反应过程中逐渐传递给下一级，最终电子会被氧化性辅酶Ⅱ的还原酶利用从而产生还原型辅酶Ⅱ，每一个反应步骤中所涉及的组分均有一定的氧化还原能力，在本次设计中无法针对独立的组分进行精确且连贯的抑制处理，也就不能对电子传递链中的单一组分均进行作用机制的检测。选择对循环式电子传递链与非循环式电子传递链的中枢，细胞色素b6f复合物进行抑制，推测光合酶体系除甲醛的作用发生的可能区间，在此基础之上得到可能的作用机制。

图1.1 植物光反应系统示意图（摘自Nelson DL, Cox MM所编的 Lehninger Principles of Biochemistry^[13])

植物光反应从放氧复合体释放水分子的电子开始，经过反应中心P680将电子传递给质体醌，然后在细胞色素b6f复合物处将电子传递给质体蓝素，质体蓝素接着将电子交给反应中心P700，最终的电子受体为氧化型辅酶Ⅱ，在还原酶的作用下产生还原型辅酶二Ⅱ。

1.4相关研究现状及探索目的

1.4.1 现阶段植物光合酶体系的研究现状

对于植物中的光合酶体系的研究有许多，正因为植物的光合作用能直接从太阳能中获取能量用于生命活动，而这也恰恰是因为光合酶体系存在的原因。利用植物的光合酶能捕获光电子的特性，可以在能源研究的领域引入植物的光合酶，例如基于植物光合酶开发的生物光伏电池^[14]，可以将太阳能转化为化学能并运用到生产生活之中。

现阶段在甲醛污染的治理方面的研究并未对植物的光合酶体系作深入地探索，大多与材料工程的研究内容相关，如利用含活性炭的腈氯纶纤维对生物酶进行固定化以检测产物对甲醛的去除效果^[15]，通过对固定材料的选择及改性以期望达到更佳的固定效果，酶的作用即是催化的工具，未能从生物的方面对酶做修饰或者说将生物酶与甲醛之间的作用进行深入的探究，这一领域的研究空间还是相当的广阔的。目前市场上针对甲醛污染的产品类别很多，质量也是参差不齐，比较普遍的几种为化学清除剂，物理吸附涂料，光触媒复合降解材料等等，未能有光合酶相关的产品出现，这也说明了这一方向的难度的确很大，有很多关键的东西处于未知状态，我们对于生物酶在甲醛处理方面的应用还能有更多的空间。正好比多年前生物酶还没有被人们运用在水体污染等问题的治理中，但如今的工业生产与社会生活中的很多地方都可以见到生物酶的身影，且其良好的相容性及优秀的功能性越来越被人们所重视，对它的探究越多就能越好的利用它。

1.4.2 本课题的探索目的与意义开展本设计课题是在实验室的前期研究的基础之上，发现植物光反应酶系统对甲醛具有较好的清除作用，故而拟对光反应酶系统清除甲醛作用作进一步研究，探讨光反应酶系统除甲醛的作用机制更好地开发利用光合作用这一天然光能转换系统及其氧化还原性能。通过此次的探索与研究将加深对植物光合酶体系的认识，了解其各组分的组成结构以及功能，具体来说就是认识光合作用的光反应阶段从放氧到还原型辅酶Ⅱ产生的一系列反应，对其中的一些氧化性较强的组分增进了解，从而对于光合酶处理甲醛的作用机制能得到可能的探究方向，进而通过实验设计进行验证，最终能加深对光合酶体系催化降解甲醛的认识。

第二章 植物光合酶体系的提取与制备

菠菜中的光合酶含量较为丰富，因而将其选为提取材料以制备实验所需的光合酶体系。通过对菠菜的叶片进行细胞破碎处理，将包括叶绿体在内的细胞内容物释放出来，对混合的浆液进行离心处理后再经过蔗糖的密度梯度离心方法^[16]，得到含有大量叶绿体的提取液，再利用冻融的方法破碎叶绿体，获得的产物即为所制备的光合酶体系。

2.1实验试剂与器材

实验材料：新鲜菠菜2000g，50ml离心管若干，胶头滴管若干，医用纱布一卷，碎冰块，称量纸，乳胶手套等。

实验仪器：九阳豆浆机（用来破碎菠菜的叶片细胞），冷冻离心机，制冰机，电子天平，移液枪及实验室常用玻璃器皿等。

实验中所用试剂见表2.1。

表2.1 光合酶体系提取所用试剂

30%蔗糖溶液（w/w):称取30g蔗糖加入70ml去离子水中，充分搅拌溶解后冷藏备用。

52%蔗糖溶液（w/w):称取52g蔗糖加入48ml去离子水中，充分搅拌溶解后冷藏备用。

Tris溶液(pH6.0左右):称取3.02g的三羟基氨基甲烷加入100ml去离子水中，此时溶液pH值在8.0左右，用盐酸溶液调至6.0附近。

0.35%氯化钠溶液（w/w)：称取3.5g氯化钠固体加入一升去离子水中，低温保存备用。

1mol/L氯化钙溶液：称取22.2g无水氯化钙加入200ml的去离子水中，充分溶解后低温保存备用。

2%海藻酸钠溶液(w/w）：称取2g海藻酸钠固体加入98ml的去离子水中，充分搅拌溶解后备用。

2.2实验方法

2.2.1 光合酶体系的制备

将购买的新鲜菠菜2000g清洗除去泥沙，留下叶片并初步撕碎。用豆浆机对叶片进行细胞破碎，注意加入适量的0.35%氯化钠溶液以便于加快破碎效率，也能防止因搅拌产生的热量导致温度过高，破坏酶的活力。按照实验室建立的方法对细胞破碎液进行光合酶体系的提取制备，并将制备的酶以沉淀的形态冷冻保存。

2.2.2 光合酶的含量检测

将上一部分中制备的酶沉淀解冻后用TRIS溶液悬浮，对悬浮后的酶液进行酶含量检测，所采取的方法是以乙醇提取酶液中的蛋白质，分离蛋白之后重新溶解并加入考马斯亮蓝染色之后在595nm处测定光吸收值，并根据考马斯亮蓝测定牛血清白蛋白含量的工作曲线得知酶液中所含的蛋白总量为多少，从而以酶液中的总蛋白含量来表示光合酶的大致含量。

2.2.3 光合酶的固定化

准备三个洁净的培养皿，其中一个倒入适量氯化钙溶液，一个倒入适量的TRIS溶液，剩下的一个作为制备固定化酶的容器。向剩下的的一个培养皿中用移液枪加入2ml的海藻酸钠溶液与2ml的正常酶液，混合均匀后静置一段时间待其中存在的气泡消除。将剪成同样大小的纱网置于氯化钙溶液中浸泡一段时间后取出，除去表面附着的氯化钙溶液，然后将其放入含有待固定化的混合酶液中，让其两面均匀的覆盖混合酶液，接着将其快速放入装有氯化钙溶液的培养皿中浸泡，待钙离子与海藻酸钠螯合形成凝胶后将其取出，置于TRIS溶液中静置待用，这所得的凝胶即为固定化的光合酶。