摘 要

本文旨在武汉理工大学环境中通过富集、初筛筛选具有碱性蛋白酶产生菌，比较透明圈以及H/C值筛选出了3株菌株。然后对初筛选出来的菌株进行酶活测定，进而选出酶活力大的C2菌株，并且对其进行镜检，发现它是杆状菌，革兰氏检验，发现它是革兰氏阳性菌。之后对筛选出来的C2菌株进行酶活测定以确定其酶活力大小；最后摸索其生长的最适培养条件，发现C2菌株的最适pH为10、最适温度为33℃。筛选出来的菌株可以保存起来，用于一般实验室的实验，也可以根据菌株的最适培养条件为以后从校园土壤里筛选产碱性蛋白酶菌株提供依据，大大减少实验时间与工作量。

论文主要研究了碱性蛋白酶菌株的筛选、酶活力测定及最适培养条件的探索。

研究结果表明：这种方法操作简单、成本低廉，适用于一般实验室筛选碱性蛋白酶菌株。

本文的特色：用相对简单的方法选育出活力较高的碱性蛋白酶菌株。

关键词：碱性蛋白酶产生菌；筛选；碱性蛋白酶；酶活力；最适培养条件

Abstract

In this paper, three strains were screened by enrichment and screening with alkaline protease producing bacteria, more transparent circles and H / C values in the campus environment.And then the enzyme selected from the initial screening of the enzyme activity determination, and then select the enzyme activity of large C2 strain, and its microscopic examination, Gram test, found that it is Gram-positive bacteria.The optimum conditions for the growth of C2 strain were determined, and the optimum temperature was 33 ℃.The selected strains can be stored for general laboratory experiments and can be used to provide the basis for the screening of alkaline protease strains from the soil in the field according to the optimum culture conditions of the strain, which greatly reduces the experimental time and the workload.

In this paper, the screening of alkaline pro-tease strains, the determination of enzyme activity and the optimum culture conditions were studied.

The results show that this method is simple and inexpensive and suitable for general laboratory screening of alkaline pro-tease strains.

The characteristics of this paper: a relatively simple method of breeding high activity of alkaline pro-tease strains.

Key Words：Alkaline pro-tease - producing bacteria; alkaline pro-tease; enzyme activity; optimum culture conditions;filter.

目 录

第1章 绪论 1

1.1 微生物碱性蛋白酶产酶菌种 2

1.2. 碱性蛋白酶的结构 2

1.2.1 嗜冷碱性蛋白酶 2

1.2.2 嗜盐碱性蛋白酶 3

1.2.3 芽胞杆菌属碱性蛋白酶 3

1.2.4 克劳氏芽胞杆菌碱性蛋白酶 3

1.3 碱性蛋白酶的性质 3

1.3.1 底物特异性 3

1.3.2 最佳pH与温度 4

1.3.2 金属离子和稳定剂/添加剂的影响 5

1.4 碱性蛋白酶的作用机制 5

1.5 碱性蛋白酶在工业中的应用 6

1.5.1 碱性蛋白酶在洗涤工业中的应用 6

1.5.2 碱性蛋白酶在丝绸脱胶中的应用 6

1.5.3 碱性蛋白酶在皮革工业中的应用 7

1.5.4 碱性蛋白酶在食品工业中的应用 7

1.5.5 碱性蛋白酶在饲料添加剂中的应用 7

1.6 论文的研究目的与意义 8

第2章 材料与方法 9

2.1实验材料 9

2.1.1 土样来源 9

2.1.2 主要仪器设备 9

2.1.3 其他辅助器材 9

2.1.4 实验试剂 10

2.1.5 培养基 10

2.2. 碱性蛋白酶菌株的筛选 10

2.2.1 样品的预处理 10

2.2.2 菌株的初筛 11

2.2.3 菌株的复筛 11

2.2.4 菌种的形态学鉴定 11

2.3 碱性蛋白酶的酶活力测定 12

2.3.1 酪氨酸标准曲线的绘制 12

2.3.2 福林法测碱性蛋白酶活力 12

2.4 碱性蛋白酶菌株的最适培养条件的探索 13

2.4.1 最适pH的测定 13

2.4.2 最适温度的测定 14

第3章 结果与分析 15

3.1 碱性蛋白酶菌株的筛选 15

3.1.1 碱性蛋白酶菌株的初筛 15

3.1.2 碱性蛋白酶菌株的复筛 16

3.2 碱性蛋白酶的酶活力测定 17

3.2.1 酪氨酸标准曲线的绘制 18

3.2.2 福林法测碱性蛋白酶活力 18

3.3 碱性蛋白酶菌株的最适培养条件的探索 19

3.3.1 最适pH的测定 19

3.3.2 最适温度的测定 20

第4章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 23

第1章 绪论

碱性蛋白酶普遍存在于动物内脏、细菌和真菌中，并且丝氨酸残基是碱性蛋白酶的活性中心，所以在许多文章里碱性蛋白酶也称丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的分子量在15-30kDa，等电点PI约为9.0，在低温下比较稳定，但是当温度为65℃时会迅速失活。此类蛋白酶的最适pH—般为9.5-10.5。1913年Rohm等人首先发现在洗涤浸泡的时候加入胰蛋白酶可以加强洗涤效果,1945年瑞士Dr.Jaag等人在微生物中发现了丝氨酸碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是现代社会最重要的工业酶制剂的原材料,如今在许多工业领域之中都被运用。由于微生物分泌的蛋白酶都会在细胞外起作用,而且微生物分泌的蛋白酶有许多动植物所没有的工业生产优点，故而如今许多蛋白酶的生产多数运用微生物来生产。并且由于微生物蛋白酶的有这些优点,使得微生物蛋白酶比动、植物源蛋白酶更易于实现工业化大规模生产。而且碱性蛋白酶有较好的耐碱性、耐热性,并且拥有较高的蛋白水解能力,所以国内外都将碱性蛋白酶列为研究重点。