1. 研究目的与意义（文献综述）

基因枪法，又被称为生物弹道技术（biolistic techology，是由美国康奈尔大学生物化学系的sanford教授在1987年[1] 提出的一种基因转化的新方法。他成功的应用基因枪对洋葱表皮的细胞进行转化。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨(它们比重大, 而且、化学性质都很稳定)颗粒获得足够的动量，突破角质或细胞壁（膜），打入靶细胞或组织，并使外源基因在细胞中稳定遗传和表达。这种技术已经广泛应用于植物研究，比如玉米[2]、小麦、水稻、大豆[3]、荔枝[4]等，是改良农作物的有效方法。因为基因枪转化技术具有转化材料广泛，细胞、组织、器官均可用作转化受体，基因型限制较小的优点，是其他基因转化技术所不能取代的[5][6]。作为一种物理转化，而不是化学转染过程，基因枪转化技术在细菌[7]、哺乳动物细胞[8]、神经元[9]乃至组织[10]（比如肌肉[11]、肝[12]、心脏[13]）都有被研究应用。传统基因枪是需要依靠高气压推动微粒子轰击的台式基因枪，体积偏大，应用场地受限，只能用于细胞转化而不能用于活体转化，因为金粉价格的昂贵，每枪轰击成本都很高。目前应用最广泛的基因枪仪器是helios基因枪[14]，由bio-rad公司研发的一款手持式基因枪。该系统通过可调节的氦气脉冲，来带动位于小塑料管内壁处预包dna的金粉颗粒，转化率高、可重复性好，不仅能够使dna直接被导入细胞质中而不受到损害，而且导入细胞的dna能持续表达。每一枪轰击平均需要0.5-5mg的金颗粒包裹1-10ug的dna[15]。作为一种操作简便、可控度高、无宿主类型限制、受体类型广泛的技术，基因枪转化技术有望将缓释药物、外源基因直接导入人体内的有关组织与器官，来弥补生物医学工程现阶段的研究局限。然而，该技术也用应用上的不足：微米级别的金或钨颗粒沉积在细胞或人体中会带来负面作用[16]。基因枪技术常用的微弹材料金和钨就属于重金属类，能与蛋白质、酶发生相互作用，使它们失去活性。重金属在人体内慢慢积累会导致慢性中毒。

羟基磷灰石（hydroxyapatite，hap）是动物和人体骨骼的主要无机矿物成分，具有良好的生物相容性和化学稳定性。大量的生物相容性实验证明羟基磷灰石无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不致溶血、不破坏生物组织[17]。纳米级别的羟基磷灰石更是表现出较高的可吸收性和可降解性。据研究表明，超细羟基磷灰石颗粒对多种癌细胞的生长具有抑制作用，而对正常细胞没有影响。因此，纳米羟基磷灰石的应用研究已成为生物医学领域中一个非常重要的课题。朱晒红[18]等人发现羟基磷灰石纳米颗粒可以作为一种新型基因转染载体材料，也就说明羟基磷灰石颗粒具有吸附dna的能力。本研究的目的是制备羟基磷灰石颗粒（0.8um-1.5um），探索它是否能作为代替纳米金的微弹材料应用在基因枪转化技术上，并且研究hap负载 dna的最佳条件和基因枪系统的最佳仪器工作参数，以达到一定的基因枪转染效率。

2. 研究的基本内容与方案

2、研究（设计）的基本内容、目标、拟采用的技术方案及措施

2.1 研究的基本内容

2.1.1 化学沉淀法合称羟基磷灰石微粒。将准确称量的ca(h₂po₄)₂·h₂o溶于去离子水，搅拌使其充分溶解，在去离子水中加入过量ca(oh)₂粉末，搅拌使其充分溶解，得澄清ca(oh)₂饱和溶液。按ca/p摩尔比1.67，将ca(oh)₂饱和溶液滴入快速搅拌的ca(h₂po₄)_2，搅拌混合均匀，乳白色沉淀在反应过程中不断出现，待反应结束后，超声处理数次，得到稳定透明的胶体溶液。

3. 研究计划与安排

第1-2周：查阅文献资料，拟定实验计划，完成开题报告。

第3-5周：培养大肠杆菌，提取质粒dna;制备1umhap微粒，并探索hap包被pdna的比例。

第6-12周：分别用纳米金和hap微粒做微弹材料，用基因枪将外源基因打入洋葱表皮细胞，进行愈伤组织培养，获得稳式转化的洋葱表皮细胞

4. 参考文献（12篇以上）

[1]klein t. m., wolf e. d., wu r. amp; sanford j. c. high-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. nature 327, 70–73 (1987).
[2]klein t. m., fromm m,weissinger a,tomes d,schaaf s,sletten m,sanford j.c. transfer of foreign genes into maize cells with high-velocity microprojectiles. proc natl acad sci usa 85:4305-4309(1988)

[3]wang y-c,klein t.m,fromm m,cao j,sanford j.c,wu r transient expression of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bombardment. plant mol biol 11:433-439(1988)

[4]桑庆亮，赖钟雄，林玉玲，陈裕坤 荔枝基因枪转化及其gus瞬时表达研究 .热带作物学报 2014，35（11）：2223-2229