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通过将各种CRISPR/Cas9载体DNA显微注射到冻融的受精卵中,产生敲除小鼠

背景:规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)介导的基因组编辑可以实现基因工程小鼠的快速生产｡为了充分利用这一创新技术,对(CRISPR)/CRISPR载体的健壮构造､对小鼠卵母细胞的有效准备和改良的基因型策略,这需要一种简化的程序｡虽然我们以前演示过卵母细胞冷冻保存技术和各种基因分型方法在生产中的适用性转录激活子样效应子核酸酶介导的小鼠基因组编辑,尚未得到澄清这些技术可以应用于CRISPR/Cas9介导的敲除小鼠的产生｡在这项研究中,我们研究使用几个CRISPR/Cas9系统创建敲除小鼠的简单,高效和可靠的方法｡

结果:我们构建了三种类型的CRISPR/Cas9载体,其表达:1)引导RNA(gRNA)和Cas9核酸酶2)两个gRNA和Cas9切口酶以及3)两个gRNA和FokI-dCas9,靶向相同的基因组｡这些载体直接显微注射入冻融受精卵母细胞,并存活卵母细胞转移到假孕ICR小鼠｡Cas9核酸酶导致最高的突变率最低出生率,而Cas9切口酶导致出生率最高,突变率最低的FokI-dCas9呈现平衡良好的突变和出生率｡此外,我们构建了一个单一的一体式FokI-dCas9载体靶向两个不同的基因座,并通过囊胚分析验证其功效,导致高度的变异有效的同时靶向诱变｡

结论:我们的报告提供了研究人员友好的综合程序选择CRISPR/Cas9介导的敲除小鼠,具有先进的施工系统,适用于各种类型的CRISPR载体,方便制备体外受精或交配的冻融卵母细胞,以及有效的突变筛选方法｡

关键词:敲除小鼠,原核显微注射,体外受精,冻融,CRISPR/Cas9,FokI-dCas9

背景

近几十年来,基因工程小鼠(GEM)在阐明特定基因的功能,疾病机制,胚胎发生和差异表达方面起着重要的作用｡尽管全世界都有大量的基因工程小鼠被制造和分析,但是仍然有一种更有效的需求生成新的基因工程小鼠的方法｡使用可编程核酸酶的基因组编辑,如锌指核酸酶(ZFN),转录激活物样效应核酸酶(TALENS)以及聚集的定期交织的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)是产生GEM的简单有效的策略｡特别地,由于其简单的构建和高DNA双链断裂(DSB)诱导活性,CRISPR/Cas9提供了最方便的方法去产生GEM｡传统的CRISPR/Cas9系统由Cas9核酶和单导RNA(gRNA)组成,目标是一个指定的基因组位点,包含由gRNA定义的20个碱基序列,以及由Cas9定义的一个原始间隔基(PAM)序列,然后这个复合物裂解双链DNA｡DSBs主要由易出错的非同源端连接(NHEJ)修复,随机诱导插入或删除,从而导致有针对性的基因中断｡

传统的CRISPR/Cas9复合物不像ZFN和TALENS那样形成二聚体,并且它通常导致高频失靶突变｡据报告,虽然动物胚胎,特别是小鼠和大鼠的胚胎,异常突变的频率不是很高,但它们确实存在,因此即使在动物中也存在潜在的风险｡ 为提高特异性,已经开发了两种衍生技术;使用Cas9切口和FokI二聚化的双切口使用与FokI(FokI-dCas9)融合的核酶缺陷型Cas9｡在两种策略中,配对的gRNA用于在目标基因组座位的并置位置上吸引两个Cas9切口分子或FokI-dCas9,导致DNA切割｡重要的是,单个gRNA引导的Cas9切口酶只能诱导缺口,其比DSB诱变更少｡此外,单gRNA引导的FokI-dCas9完全不损伤基因组的DNA｡因此,这两种衍生策略的脱靶突变显着降低｡

为了使用CRISPR/Cas9系统产生敲除小鼠,Cas9mRNA和gRNA通常使用体外转录合成并用于显微注射｡然而,MAshIkO及其同事描述了使用表达Cas9和gRNA的环状质粒的原核显微注射的简化方案｡直接使用质粒避免了费力的体外转录和纯化步骤的需要,并且质粒与RNA相比提供高稳定性,使得能够强大地产生敲除小鼠｡此外,我们最近建立了一个一体化CRISPR/Cas9载体系统,用于在单个载体中组装多个gRNA盒和Cas9核酸酶/切口酶盒｡结合这些方法,已经认为可以实现由成对的gRNA引导的CRISPR系统介导的敲除小鼠的有效生产｡

关于用于显微注射以产生具有基因组编辑技术的敲除小鼠的卵母细胞的制备,通常通过交配雄性小鼠和超排卵的雌性小鼠来收集受精卵母细胞｡然而,为每个实验准备新鲜的受精卵,是耗时且费力的工作｡我们以前已经建立了一种使用由体外受精(IVF)产生的冻融受精卵母细胞进行TALEN介导的敲除小鼠的