摘 要

关节软骨在关节的功能中起着十分重要的作用。由于其无血管无细胞的特性，一旦受到损伤，就不能自发地愈合。目前，细胞外基质（ECM）引起了组织工程支架和干细胞研究的广泛关注。 ECM支架虽能较好的模拟组织环境，但其缺乏机械强度，并且组织去细胞化有些关键步骤并未得到解决。对于这些缺陷，我们设计了一种富含ECM的PEGDA支架以用于软骨修复，其包含水凝特定物理结构的同时，也拥有ECM特定的生化环境如生长因子等，能利于指导骨髓间充质干细胞成软骨方向分化。在本研究中，我们通过从细胞微球中提取ECM来改善支架的形成，以此方式可以使每个支架中ECM的含量标准化。通过以不同比例（100:0，75:25，100：0）将软骨细胞与BMSCs共培养获得三种不同的细胞微球，并用成软骨分化培养基诱导培养21天。最后，将BMSCs悬浮于过滤灭菌的三种10％PEGDA-ECM溶液和对照组10％纯PEGDA溶液中，通过光交联种BMSCs的方式形成复合水凝胶支架，并在水凝胶三维环境下诱导分化培养骨髓间充质干细胞。最后，我们发现1）通过质子核磁共振（¹HNMR）测定，PEGDA的酰基化率达97％;2）PEGDA-ECM水凝胶比PEGDA水凝胶溶胀比和平衡含水量更大，能吸收更多培养基，为BMSCs提供更好的3D生长环境;3）三种类型PEGDA-ECM水凝胶组均比纯PEGDA水凝胶显示更高的细胞活性，并表达出更多的II型胶原，糖胺聚糖等软骨特征表达物;4）100％软骨细胞组明显能产生更多的II型胶原、GAG和特征基因的最高水平的表达，如ACAN和COL2A1等。综上述，本实验构建的PEGDA-ECM复合支架较传统的PEGDA支架能有更显著的促进骨髓间充质干细胞成软骨分化的功效。

关键词：PEGDA-ECM复合水凝胶；骨髓间充质干细胞；成软骨分化；软骨组织工程

Abstract

Articular cartilage plays a vital role in joint function. Once damaged or injured, it cannot heal spontaneously due to its avascular nature and spares cell population [1]. Nowadays, extracellular matrix (ECM) has drawn a broad attention for preparation of tissue engineering scaffolds and stem cell study [2]. ECM scaffolds stepwise mimicking development of tissues, but it is lack of mechanical strength, and the crucial step for decellularization in tissue or scaffold is far from expectation. For those defects, we designed a PEGDA scaffold enriched with ECM for cartilage repair, which contains both structural and biological signals to guide MSCs chondrogenic differentiation while at the same time maintaining physical scaffolding properties. In this study, we improve the formation of scaffold by extracting ECM from cell pellets, which can normalize the content of ECM in each scaffold. Three different cell pellets were obtained by co-culturing chondrocytes with BMSCs at varying ratios(100:0,75:25,0:100) and cultured with chondrogenic culture media for 21 days. Finally, BMSCs were suspended both in filter-sterilized 10%PEGDA-ECM solution and 10% pure PEGDA solution as control for 3D chondrogenic culture by photocrosslinking. Finally，We found that 1) Methacrylation of the PEGDA reaction was over 97% as determined by proton nuclear magnetic resonance(1HNMR), 2) the PEGDA-ECM hydrogels swelling more culture medium than PEGDA hydrogels which gave a better 3D growth environment for BMSCs, and 3) all the three types of PEGDA-ECM hydrogel groups showed higher cell activity and expressed more collagen typeⅡ, GAG, than pure PEGDA hydrogels. Moreover, 4) the 100%chondrocytes group produced significant more collagen typeⅡ, GAG, as well as the highest levels of genes, such as ACAN and COL2A1 than other groups. In this study, PEGDA-ECM composite scaffolds have more effective effect on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cartilage than traditional PEGDA scaffolds.

Key Words: PEGDA-ECM hydrogel; BMSCs; chondrogenesis; cartilage tissue engineering

目录

第1章 绪论 3

第2章 PEGDA的合成与表征 5

2.1实验试剂及用量 5

2.2 实验仪器 6

2.3 实验步骤 6

2.3.1干燥甲苯 6

2.3.2 干燥PEG 6

2.3.3 酰基化反应 7

2.3.4 PEGDA的纯化 7

2.3.5 PEGDA的保存 8

2.4 PEGDA产物表征 8

第3章 细胞外基质的获取 9

3.1 BMSCs的原代及传代培养 9

3.1.1 实验试剂 9

3.1.2 实验仪器 9

3.1.3 BMSCs原代分离培养 9

3.1.4 BMSCs传代培养 10

3.2 大鼠软骨细胞的解冻培养 10

3.3 细胞微球的形成及培养 11

3.3.1 实验设计 11

3.3.2 软骨分化培养基的配制 11

3.3.3 离心法形成细胞微球 11

3.4 细胞外基质（ECM）的获取 12

第4章 PEGDA-ECM复合水凝胶的构建及表征 13

4.1 PEGDA-ECM复合水凝胶支架的构建 13

4.2 水凝胶溶胀比测定 13

4.3 含细胞水凝胶制备 13

第5章 成软骨分化检测与评价 15

5.1 实验试剂与仪器 15

5.1.1 实验试剂 15

5.1.2 实验仪器 16

5.2 生化含量分析 16

5.2.1 DNA总含量测定 16

5.2.2 组织糖胺多糖（GAG）含量测定 17

5.2.3羟脯氨酸含量测定 17

5.3 组织学检测 18

5.4 基因表达分析 19

5.4.1 RNA提取 19

5.4.2 RT-PCR 19

第6章 结果与讨论 21

6.1 PEGDA的化学表征 21

6.2 水凝胶溶胀比及平衡含水量 21

6.3 生物化学检测分析 23

6.3.1 DNA 总含量测定 23

6.3.2 collagen净含量 23

6.3.3 GAG净含量 24

6.4 组织学染色分析 25

6.4 基因表达分析 27

第7章 讨论 29

参考文献 31

致谢 33

绪论

人关节软骨是一层2-5mm厚度的透明软骨组织，在膝关节内起着润滑、减震和承重等重要作用[1]。随着老化及运动的普及，关节软骨退行性病变以及关节软骨缺损性疾病的发病率非常高[2]。软骨组织由于缺乏血管和神经从而缺乏再生能力。目前，各种临床治疗手段均无法再生出理想的功能性软骨组织[3]，许多治疗手段也只能暂时延缓关节软骨退化的速度，最后都只能通过关节置换手术进行治疗[4]。然而，所置换的人工关节使用年限最长不超过10年，再次手术将给病人造成巨大的病痛和经济负担。

随着组织工程技术的不断发展，多种较为保守的关节软骨治疗手段已经取得了很大进展。组织工程（tissue engineering）是一门以细胞生物学和材料科学等多种学科相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴交叉学科。软骨组织工程的目的是在体外构建出具有生理功能的软骨组织替代物，经体内移植后可以长期存活，并对软骨损伤区域进行修复。软骨组织工程包含几个基本要素：细胞、生物材料、生长因子和生物制造等。其中，生物材料能提供一个仿生的、能够有效诱导软骨组织形成适宜软骨细胞生长的三维环境，在软骨组织工程中发挥着重要的作用。