摘 要

为探究在纳米二氧化钛胁迫下拟南芥转录因子WRKY70介导的响应机制，以拟南芥为实验对象，从生理生化和分子层面探究了拟南芥野生型（Col-0）和wrky70突变体暴露于0、25、50、100 mg·L^-1纳米二氧化钛中的变化。结果显示：100 mg·L^-1纳米二氧化钛使拟南芥野生型（Col-0）种子的发芽率明显下降，而对wrky70突变体的种子发芽率无显著影响。另外，随着纳米二氧化钛浓度的升高，拟南芥野生型（Col-0）和wrky70突变体幼苗的根长增长量均呈先增加后减小的趋势，其中wrky70突变体根长的增长量尤其显著。纳米二氧化钛浓度在50 mg·L^-1及以上会降低拟南芥叶片叶绿素含量，增大细胞膜脂过氧化程度并使细胞脯氨酸含量升高。与野生型（Col-0）相比，wrky70突变体幼苗的膜脂过氧化程度低，但脯氨酸含量高。同时，抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶 (POD) 的活性变化及DAB染色结果表明 wrky70突变体对纳米二氧化钛胁迫的耐受性较野生型（Col-0）更强。另外， wrky70突变体中谷胱甘肽合成酶基因GSH1的相对表达量明显高于野生型（Col-0），猜测wrky70突变体中谷胱甘肽合成途径已经被激活。其它硫同化及胁迫相关基因在纳米二氧化钛处理后表达水平未出现明显变化，这可能与纳米二氧化钛粒子本身的特性和处理时长有关。本研究对于阐明纳米材料的生物效应及植物抗纳米材料胁迫的分子机制具有重要意义。

关键词：纳米二氧化钛；胁迫；拟南芥；WRKY70；转录因子

Abstract

In order to explore the response mechanism mediated by the transcription factor WRKY70 of Arabidopsis under the pressure of Nano titanium dioxide, Arabidopsis was used as the experimental object. The physiological, biochemical and molecular aspects of the changes in exposure to 0, 25, 50, and 100 mg·L^-1 nanometer titanium dioxide in the wild type (Col-0) and wrky70 mutants were investigated. The results showed that 100 mg·L^-1 nanometer titanium dioxide significantly reduced the germination rate of the wild type (Col-0) seeds, but had no significant effect on the germination rate of wrky70 mutants. In addition, with the increase of nanometer titanium dioxide concentration, the growth of root length of the wild type (Col-0) and wrky70 mutant seedlings increased first and then decreased, and the growth of the root length of the wrky70 mutant was particularly significant. Nano titanium dioxide concentration of 50 mg·L^-1 and above will reduce the chlorophyll content of mustard leaves, increase the degree of membrane lipid peroxidation and increase the content of proline in cells. Compared with the wild type (Col-0), the membrane lipid peroxidation of the wrky70 mutant seedlings was low, but the proline content was high. Meanwhile, The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) and DAB staining in the antioxidase system showed that the wrky70 mutants were more resistant to titanium dioxide stress than the wild type (Col-0). In addition, the relative expression of GSH1 gene was significantly higher than that of wild type (Col-0) in the wrky70 mutants, indicating that the synthesis pathway of glutathione in the wrky70 mutants had been activated. There was no significant change in the expression level of other sulfur assimilation and stress related genes after nanometer titanium dioxide treatment, which may be related to the characteristics and treatment time of nanometer titanium dioxide particles. This study is of great significance for elucidating the biological effects of nanomaterials and the molecular mechanisms of plants against nanomaterials stress.

Key Words： nano titanium dioxide; stress; Arabidopsis thaliana; WRKY70; transcription factor

目 录

第1章 绪论 1

1.1 项目背景 1

1.2 植物对纳米材料的生物效应的研究现状 1

1.3 WRKY转录因子介导的植物抗纳米二氧化钛胁迫反应机制尚未被揭示 2

1.4 研究目的及意义 3

1.5 研究技术路线 3

第2章 材料与方法 4

2.1 试验材料 4

2.2 试验主要试剂 4

2.3 试验主要仪器 5

2.4 试验方法 5

2.2.1 纳米二氧化钛的表征及在拟南芥组织中的分布 5

2.2.2 拟南芥植株的培养 6

2.2.3 拟南芥种子萌发情况及根长测定 6

2.2.4 叶绿素、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及抗氧化酶活性测定

6

2.2.5 DAB染色 7

2.2.6 基因表达水平检测 7

2.2.7 数据处理 8

第3章 结果和分析 9

3.1 纳米二氧化钛的表征 9

3.2 纳米二氧化钛在拟南芥植株中的分布 9

3.3 纳米二氧化钛对拟南芥种子发芽率及主根长度的影响 10

3.4 纳米二氧化钛对拟南芥幼苗叶绿体色素含量的影响 11

3.5 纳米二氧化钛对拟南芥幼苗可溶性蛋白及可溶性糖含量的影响 11

3.6 纳米二氧化钛对拟南芥幼苗丙二醛及脯氨酸含量的影响 12

3.7 纳米二氧化钛对拟南芥幼苗三种抗氧化酶活性的影响 13

3.8 纳米二氧化钛对拟南芥幼叶H₂O₂含量的影响 14

3.9 纳米二氧化钛对拟南芥幼苗胁迫相关基因表达的影响 15

第4章 结论 16

参考文献 17

致谢 19

第1章 绪论

1.1 研究背景

纳米材料是指由颗粒尺寸介于1~100nm的纳米粒子构成的材料。其中，纳米二氧化钛是使用最广泛的纳米材料之一，因其所具有的与一般材料所不同的优异的理化性质而被广泛应用于商业、工业、建筑和个人护理产品等领域^[1]。然而，随着纳米二氧化钛的广泛使用，越来越多的纳米粒子被释放到环境中，人们对纳米粒子进入环境后带来的风险和效应也存在着较多的争议^[2]。研究表明，美国污泥中纳米二氧化钛含量约137mg·kg^-1[3]，这些被释放到环境中的纳米二氧化钛通过富集作用进入生物体内，从而引起潜在的生物毒性和生态问题。近年来，关于纳米材料生物毒性的研究主要集中在动物细胞和微生物上，而对植物纳米生物效应的研究还处于初步探索阶段，相关的机制还未被揭示。

1.2 纳米材料对植物生物效应的研究现状