摘 要

本文借助基于16S rDNA的高通量测序技术，研究了2018年4月的微生物群落结构和多样性，所得结果对探究富营养化水体中细菌群落结构组成和对南湖蓝藻水华进行早期预警有指导意义。

论文在武汉市南湖4个位点进行了取样，经过DNA提取、PCR扩增和纯化以及高通量测序，研究结果表明，从门水平来看，水样中蓝藻细菌门（Cyanobacteria）平均相对丰度均较高; 从纲水平来看，水样中的优势细菌主要为未分类的放线菌纲( unidentified Actinobacteria) 和未分类的蓝藻细菌纲( unidentified Cyanobacteria)；从属水平来看，水样中微囊藻属( Microcystis) 占优势，其次为hgcI clade。

关键词: 南湖；高通量测序；16S rDNA；微生物；水环境

Abstract

In this paper, the structure and diversity of microbial community in the April 2018 were studied by means of high throughput sequencing technology based on 16S rDNA, and the results were helpful to explore the composition of bacterial community structure in eutrophic water and early warning of cyanobacteria bloom in Nanhu Lake. The results showed that the average relative abundance of cyanobacteria in water samples was higher than that in water sample, after DNA extraction, PCR amplification and purification and high throughput sequencing in four sites of Wuhan. From the point of view, the dominant bacteria in water samples are unidentified Actinobacteria and the classification of unidentified cyanobacteria, the subordinate level, in water samples of Microcystis prevailed, followed by hgcI clade.

Keywords: South Lake; high-throughput sequencing; 16S rDNA; microorganism; water environment

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 2

1.1 研究背景以及研究目的 2

1.2水环境微生物的群落结构和丰度 3

1.3 16S rDNA 4

1.4 水环境微生物的研究方法 4

1.4.1 传统微生物研究方法 4

1.4.2 PCR扩增技术 5

1.4.3 高通量测序技术 6

第2章 材料与方法 8

2.1 采样点简介以及采样 8

2.2 方法 9

2.2.1土壤理化性质 9

2.2.2 水样DNA的提取 9

2.2.3 PCR扩增和纯化 10

2.2.4 高通量测序数据分析 11

第3章 结果与分析 12

3.1 水样理化参数 12

3.2 南湖水样不同位点16S rDNA丰度 12

3.3 南湖细菌群落结构 13

3.3.1 门水平细菌 13

3.3.2 纲水平细菌 14

3.3.3 属水平细菌 15

第4章 总结与展望 16

参考文献 17

第1章 绪论

1.1 研究背景以及研究目的

随着社会经济发展，众多企业产生大量三废，并将之直接排入湖泊。这造成了水生生态系统严重的环境污染。这使得水生生态系统遭到了严重污染，尤其是位于湖北省武汉市周边湖泊如南湖、汤逊湖、金银湖、梁子湖等等。与此同时，许多湖泊频繁发生水华现象，对经济发展和人民生活造成严重影响[^[1]]。水华的爆发是一种在各种生物因素和非生物因素综合作用下发生在富营养水体中的有害生态现象。富营养化是指水体中氮，磷等养分过多，使浮游植物和水体中的其他生物过度增殖，降低水体中的半透明性和含氧量，导致水质差，富营养化严重，水华爆发。除此之外，水华还产生藻类毒素和异味物质，供水安全受到严重影响，环境遭到严重破坏，造成其他生物中毒，进而生态系统紊乱。中国多个水域，包括太湖，滇池，巢湖，汉江，渤海，东湖等水华现象频繁出现，给中国的环境，经济，交通等造成了巨大损失，给湖泊生态系统带来严重后果[^[2]]。 20世纪六七十年代，大大小小一百多个湖泊遍布武汉市，随着经济的发展和大量的住房建设，湖泊数量已增加到近200个。一个或几个主要湖泊的分解导致了众多小湖的出现。与此同时，武汉湖滨地区人口不断增加，排入湖泊的污水和污染物的数量也在日益增加，导致该地区近年来湖泊水污染问题日益突出。

武汉市南湖处于长江中游，是一个淡水湖泊，位于武汉洪山区。二十世纪，南湖水质清洁无污染，有约1000公顷的前湖面积[^[3]]。这些湖泊构成了一个良好的水生态系统，用于自我控制和调节。而21世纪以来，由于武汉各方面的快速发展，经济发展迅速增长。这导致了南湖现有湖泊面积不足500公顷的事实。此外，湖泊周围的人口增加，湖泊面积变得越来越少；作为浅水且相对营养丰富的湖泊，连同大量的工业和农业废物和生活污水流入湖中，水体的富营养化加剧，生态系统结构也发生了恶性变化，生物多样性下降。这导致了近十年来南湖水体年年水华，以及大量水生生物的死亡。政府部门倘若不及时采取措施，长期发展下去，不仅会阻碍经济的发展，还会导致交通混乱、空气污染、水体恶化，并危及到周边居民的身体健康。南湖已经成为武汉治理湖泊的重点对象[^[4]]。

武汉政府部门在2017年8月颁布了《武汉市贯彻落实中央第三环境保护督察组反馈意见整改方案》，大力开展蓝藻打捞、疏浚清淤、调水引流等措施，实施截污工程，重点整治工业污染水，同时加强农村水污染的防治以及城市污染防治。但是根据长期监测结果发现，与其他湖区如武汉市东湖景区相比，南湖湖区水质较差，蓝藻水华仍频繁发生。不少学者已经研究了南湖蓝藻暴发机理、蓝藻水华预警、浮游植物分布、营养元素的转化和重金属分布及生态风险评估，也分别对浮游细菌和沉积物细菌进行研究，但是对南湖微生物结构以及种类同时开展研究的报道还较少[^[5]]。

利用传统的显微镜观察方法研究微生物的多样性受到各种条件的制约，如工作量大，要求观察者有丰富的微生物观察经验等等。由于其高分辨率和同时分析数百个样本的能力，高通量测序通过测序微生物群落的DNA并与数据库中的现有序列进行比较来获得微生物多样性的数据。该方法不需要人工培养，也不需要肉眼识别，工作量小，人为影响因素小，数据量大，除此之外还可能发现微生物新物种。因此，高通量测序越来越受到研究者的关注，是研究细菌群落组成的重要工具，已成为研究水华与微生物关系的一种新方法。一些学者利用高通量测序技术研究了对高原淡水湖泊、长江和太湖[^[6]]水环境、土壤环境的细菌多样性以及群落结构，吴玲等[^[7]]采用 Illumina测序技术研究发现太湖沉积物中古菌和湖泛之间的关系，但利用高通量测序技术研究武汉市南湖细菌群落结构的研究还鲜有报道。蓝藻水华主要集中在春季以及夏季，因此本课题基于 16S rDNA高通量测序技术与多种统计分析方法，探究武汉市南湖在四月份微生物群落的多样性，为了解该湖区富营养化水体中微生物群落结构组成、以及对南湖水华爆发进行早期预警提供依据。

1.2水环境微生物的群落结构和丰度

微生物群落结构一直是微生物生态学和环境研究的焦点。第一，群落结构决定了生态功能的性质和强度。第二，群落结构的高度稳定性是实现生态功能的重要因素。第三，群落结构的变化是环境变化的一个重要标志。因此，通过研究目标环境中的微生物群落结构和多样性，可以为优化群落结构、调节群落功能、发现重要的微生物功能群提供可靠的依据[^[8]]。