摘 要

细胞外基质(ECM)因其富含细胞生长所需要的多种生长因子在组织工程领域起着重要作用。该毕设课题将提取新鲜猪肝脏的ECM并将其冻干处理，所得到的材料可以与PEGDA构建成水凝胶用于肝细胞的体外培养，探索肝脏ECM对维持肝癌细胞的体外活性所起的积极作用，该实验通过对肝癌细胞的生长过程进行观察比照，以及对培养所得的肝癌细胞提取RNA，逆转录得到DNA，探索肝脏ECM对肝癌细胞基因表达的影响。实验结果表明，猪肝脏ECM对人肝癌细胞IL-8和VEGF基因的表达起正相关作用。可以认为，猪肝脏ECM对人肝癌细胞的特异性基因的表达有诱导作用。

关键词：肝脏ECM；立体培养；逆转录；人工肝

Abstract

The extracellular matrix (ECM) has played an important role in the field of tissue engineering because of its rich in cell growth needs a variety of growth factors.The project topics will extract ECM from the fresh liver of pig and freeze-drying the ECM .The obtained material can be used with PEGDA build into water gel for liver cells in vitro.To explore the role the liver ECM played in maintaining the liver cells activity in vitro . The experiment explores the affect to the gene expression in the hepatoma carcinoma cell of liver ECM by Observing the process of liver cancer cell growth、detecting the gene expressioncancer of the hepatoma carcinoma. The experimental results show that the ECM of pig liver plays a role of positive correlation in the expression of the gene for IL-8 and VEGF of human liver cancer cells .We can believe that the ECM of pig liver induces the expression of specific genes in human liver cancer cells.

Key Words: Liver ECM;stereoscopic cultivation;reverse transcription;artificial liver

目录

第一章 绪论 1

1.1肝脏及肝脏组织工程 1

1.2组织工程学背景 1

1.3 PCR扩增的基本原理 2

1.4去细胞基质支架材料的研究进展 3

1.4.1ECM简介 3

1.5脱细胞基质材料应用模式 4

1.6实验目的意义及方法 4

1.6.1实验研究的目的及意义 4

1.6.2实验研究方法 4

第2章 实验 5

2.1实验试剂及仪器 5

2.1.1实验试剂信息 5

2.1.2实验仪器信息 6

2.2实验方法 6

2.2.2细胞培养 7

2.2.3所培养的细胞RNA的提取 9

2.2.4RNA的逆转录 11

2.2.5c-DNA的扩增及检测 12

2.3实验结果分析： 14

第3章 结果讨论 16

3.1结论 16

3.2实验总结 16

第4章 展望 16

第5章 参考文献 17

第6章 致谢 18

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第一章 绪论

1.1肝脏及肝脏组织工程

肝脏是人体物质代谢的中枢，在葡萄糖代谢、脂质代谢、蛋白质合成以及解毒方面对起到重要的作用。当前，肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病对人类的健康造成严重威胁，全世界由肝疾病引发的死亡率达到2.5%，其中最严重的是肝功能衰竭，我国是肝癌和病毒性肝炎高发的国家，每年因此类疾病死亡近50万人，而所花费的医疗、保健费用高达1000多亿元。而急性肝功能衰竭预后不良，死亡率高达70%~80%^[1-2]。目前，针对此类疾病最有效的治疗方法就是肝移植，但是可供移植飞肝脏严重不足，大多患者死在等待供体肝脏的过程中。因此，寻找肝的替代品急需解决。而随着肝脏组织工程的研究，有了新的思路，用人工肝替代，通过肝脏组织工程技术，体外再造肝脏，用于肝衰竭患者的肝移植。

1.2组织工程学背景

组织工程学是综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，其核心内容是建立三维复合体，即在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的。这一内涵的核心是活的细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，这是组织工程学研究的主要科学问题。 肝脏组织工程研究一直是组织工程研究的热点领域之一，在近三十年的研究中，已经取得了很多的突破性进展。通过不断的实验研究，表明体外再造肝脏在肝衰竭等肝脏疾病的治疗中有很积极的作用，一定程度上可以替代肝脏组织。但由于肝脏结构和功能及其复杂，体外构建组织工程化肝脏仍旧面临许多问题，如支架相容性差，且支架材料中缺乏类似于在体内的脉管结构，导致再造肝脏体积收到限制：并且，现有的支架材料结构组分相对体内环境单一，无法为肝细胞提供与体内环境类似的微环境。所以，近年来，肝脏脱细胞基质材料在肝脏组织工程中的应用受到大量关注。

1.3 PCR扩增的基本原理

PCR反应的基本成分包括：模板DNA（待扩增DNA）、引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、适宜的缓冲液。模拟DNA的天然复制过程，其扩增的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一段时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：温度提升到72℃时DNA模板--引物结合物在TAP（DNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。但是这只是一种半定量分析，不能准确分析DNA浓度，可以用荧光定量PCR仪作实时荧光定量分析。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值，这是由于退火时反应的不稳定性决定的，可能互补链会直接形成DNA双链，自然就没进行扩增。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。