摘 要

功能生物材料在软骨组织工程中发挥着重要作用，其提供仿生的细胞微环境，能够有效促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行软骨分化。聚乙二醇（PEG）水凝胶因其优良的物理化学性质和生物相容性，而被广泛应用于软骨组织工程，但是其缺乏功能位点、生长因子等，不能有效促进软骨形成。硫酸软骨素（ChS）作为软骨细胞外基质的一种成份，具有消炎能力、理想的生物相容性、能够有效促进软骨损伤修复等优点。硫酸软骨素经甲基丙烯酸化修饰后形成硫酸软骨素丙烯酸甲酯（ChSMA），可以通过光聚合形成水凝胶，且力学性能优良。然而目前ChSMA的合成方法繁琐复杂、耗时长，而且酰基化度较低，大大降低了其应用潜能。在本研究中，建立了一种新的ChSMA合成方法，新的方法不需要pH监测计等特殊的仪器设备、成本低、工艺简单、耗时短、且酰基化度高。光交联BMSCs-PEGDA-ChSMA体外构建类软骨组织，质量溶胀比研究表明该法所合成的ChSMA在光交联过程中能够有效与PEGDA结合，并提高水凝胶支架的力学性能。生化分析、基因表达分析、组织学分析结果评价其对软骨分化具有一定的促进作用。

关键词：硫酸软骨素（ChS）；聚乙二醇（PEG）；骨髓间充质干细胞；光交联；软骨组织工程

Abstract

Functional biomaterial plays a pivotal role in cartilage tissue engineering by supplying mimicked micro-environment ideal for stem cell chondrogenic differentiation. Chondroitin sulfate (ChS) as a component of cartilage extracellular matrix (ECM) possesses advantages of anti-inflammatory capacity, biocompatibility, and improving wound healing for cartilage regeneration. Methacrylated chondroitin sulfate (ChSMA) can be photo-crosslinked with enhanced mechanical properties. However, the current ChSMA synthetic methods are complicated and time-consuming with lower degree of methacrylation. In this study, we developed a novel ChSMA synthesis approach without tedious pH monitoring during the reaction process. ChSMA generated using this cost-effective approach had a significantly higher degree of methacrylation comparing to the old method. Mass swelling results demonstrated that ChSMA covalently integrated into methacrylated polyethylene glycol (PEGDA) matrix comparing to the mixed ChS, which indicated functional integration of PEGDA-ChSMA scaffold. Furthermore, Bone mesenchymal stem cells (BMSCs) and PEGDA-ChSMA scaffold were simultaneously photo-crosslinked to create neocartilage tissue constructs with promoted chondrogenic differentiation.

Key Words: chondroitin sulfate (ChS); polyethylene glycol (PEG); BMSCs; photo-crosslinking; cartilage tissue engineering

目录

第1章 绪论 1

第2章 生物材料合成与表征 4

2.1聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）合成与表征 4

2.1.1 实验试剂 4

2.1.2 实验仪器 4

2.1.3 PEGDA合成 5

2.1.4 PEGDA表征 5

2.2硫酸软骨素丙烯酸甲酯（ChSMA）制备与表征 5

2.2.1 实验试剂 5

2.2.2 实验仪器 6

2.2.3 ChSMA制备 6

2.2.4 ChSMA表征 6

第3章 类软骨组织构建 7

3.1 BMSCs分离培养 7

3.1.1 实验试剂 7

3.1.2 实验仪器 7

3.1.3 BMSCs分离培养 7

3.2 光交联构建类软骨组织 8

3.2.1 实验试剂 8

3.2.2 实验仪器 9

3.2.3 水凝胶溶胀比测定 9

3.2.4 细胞-水凝胶构建 9

第4章 软骨分化检测与评价 11

4.1 实验试剂与仪器 11

4.1.1 实验试剂 11

4.1.2 实验仪器 12

4.2 生化分析 12

4.2.1 羟脯氨酸含量测定 12

4.2.2 组织糖胺多糖（GAG）含量测定 13

4.2.3 总DNA含量测定 13

4.3 基因表达分析 14

4.3.1 RNA提取 14

4.3.2 RT-PCR 14

4.4 组织学检测 15

第5章 结果与讨论 17

5.1 ChSMA、PEGDA表征 17

5.2 水凝胶溶胀比测定 17

5.3 生化分析 19

5.4 基因表达分析 21

第6章 结论 23

参考文献 25

致谢 27

第1章 绪论

关节软骨（Articular Cartilage）位于关节表面，由胶原纤维紧密排练而成。正常的关节软骨，表面光滑，有光泽，呈白色，透明状，其底端紧紧附着在下面的骨质上，上端朝向关节面。软骨细胞分布在这些胶原纤维之间，维持关节软骨的正常代谢。关节软骨没有神经，也没有血管，其营养成分必须从关节液中取得，而其代谢废物也必须排至关节液中。关节软骨主要的功能有润滑、承受力学负荷、吸收和缓冲应力^[1-5]。软骨组织在结构上分为三层，由表及里分别为表层（产生软骨细胞，胶原含量最高，Ⅱ型胶原平行于组织表面排列）、中层（胶原纤维随机排列，蛋白聚糖含量较高）和深层（软骨组织和骨组织交界面，胶原纤维垂直于组织表面排列）^[6]。

关节软骨损伤后可引起疼痛、滑膜炎和关节变性等，由此引发一系列关节疾病，如骨关节炎、软骨发育不全，并最终导致关节功能丧失。软骨细胞密度低、新陈代谢较慢，无血管等特性导致关节软骨自身修复能力较差，即无法自身修复。目前主要的治疗手段有关节镜下关节腔灌洗、关节软骨磨削成形术、关节清创术、激光磨蚀与软骨成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术、软骨镶嵌移植术、软骨膜移植、自体软骨细胞移植治疗等，这些临床治疗手段基本都要求在软骨损伤部位形成新的软骨，但是损伤部位的力学等条件不利于新的关节软骨的形成，因此临床治疗的成功率较低，且长期治疗效果不令人满意^[7]。