摘 要

细胞凋亡途径和toll通路都是决定细胞生存的关键途径，这些途径包括大量的酶及调控因子。通过DNA克隆技术、IP技术及western blotting技术，研究了果蝇细胞凋亡途径中的Diap1对 toll通路下游的NF-κB（Dif）的作用。成功构建了Dif表达载体。在果蝇S2细胞系中分别外源过表达Diap1，Dif；同时外源过表达Diap1，Dif，分别IP两者的标签。Ip结果表明，Diap1与Dif之间没有直接的相互作用。

关键字：细胞凋亡,toll,Diap1,NF-κB,Dif

Abstract

Both programmed cell death (apoptosis) and toll pathway,which contant lots of enzymes and regulatory factor, play key roles in cell survery.In drosophila,researched whether Diap1 in the apoptosis pathway has interaction with NF-KB（Dif）,which is a role of downstream of toll，by DNA cloning techniques, Immunoprecipitation(IP) and western blotting.Over-expressing exogenous Diap1、Dif and Diap1amp;Dif in drosophila S2 cell.result of ip indicate that there is no direct interaction between Diap1 and Dif.

Keywords：apoptosis,toll,Diap1,NF-KB,Dif

目录

摘 要 I

绪 论 1

1.1 toll调控通路 1

1.2凋亡调控途径 2

1.2.1线粒体途径 3

1.2.2死亡受体途径 3

1.2.3内质网途径 4

1.2.4caspase 4

1.2.5NF-KB途径抑制病毒感染 5

1.3 DIAP1 5

2.1 前言 7

2.2 材料 7

2.2.1菌株、细胞系及质粒 7

2.2.2 试剂盒和酶 8

2.2.3缓冲体系及反应体系 9

2.2.4目的基因片段及引物 10

2.3 方法 10

2.3.1 构建克隆 10

2.3.2目的基因在S2细胞中的表达 14

2.4结果与讨论 15

2.4.1表达载体的构建 15

2.4.2目的基因在S2细胞中的表达 15

2.4.3 Dif与Diap1 的相互作用 15

2.5 本章小结 17

第三章 结论 18

参考文献 19

附录 21

致谢 28

绪 论

1.1 toll调控通路

Toll是天然免疫的重要组成部分，在生物体内具有高度保守性。它最早是在昆虫体内发现的。Toll是一种受体蛋白，在哺乳动物内，白细胞介素1受体与toll具有高度同源性，故称作toll样受体。

Tlrs对于包括单核白细胞、巨噬细胞和树状细胞等天然免疫细胞的激活起着十分重要的作用。通过tlrs激活的巨噬细胞，对于前体炎症反应细胞因子（包括TNF、IL-1β和IL-6）的快速表达有着十分重要的作用，这些细胞因子能够促进Th17的响应，Th17在自主免疫中起到了关键的作用。很惊讶的是，在炎症反应中，tlrs的激活不仅能诱导细胞操作上的骨髓破坏，也能够抑制这一过程。细胞间和细胞内对于不同的tlrs信号有着不同的分配。内源性的或者微生物表明配体或者配位分子决定了激活还是抑制免疫反应。

对抗感染时，巨噬细胞的活化是完整的免疫反应不可或缺的一部分。多种受体和共刺激分子参与调节了持续重要的天然免疫应答。不同的刺激因子在不同的组织中分化和活化组织储存的巨噬细胞，这些细胞具有特定的表型性，例如在肾脏中为Kupffer细胞，大脑中为小神经胶质细胞，关节处为滑液巨噬细胞和破骨细胞。

Tlrs为Ⅰ型跨膜糖蛋白，在对抗微生物的免疫应答中起到十分关键的作用。Tlrs包括TLR2（与TLR1和TLR6相关联）、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9等。TLR2识别的外源性的pamps（一般为微生物配体）包括脂肪瘤、脂磷壁酸（革兰氏阳性菌）、二酰化三酰化细菌脂糖，识别的内源性的damps（一般为内源的蛋白配体）包括HSP60、HSP70、HSP96、HMGB-1、gp96、Biglycan、SP-D等。TLR4识别的外源性的pamps一般为脂多糖（革兰氏阴性菌），识别的内源性的damps包括二糖、HSP60、HSP70、HSP96、纤维蛋白原、纤连蛋白、透明质酸、HMGB-1、oxldl（与TLR6相关联）、β淀粉。TLR5识别的外源性的pamps一般为鞭毛蛋白（革兰氏阴性菌）但其识别的内源性的damps任然是未知的。不同于TLR2、TLR4、TLR5，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9识别的是核酸，其中TLR3识别外源性的病毒dsrna和内源性的mrna，TLR7识别外源性的病毒ssrna和内源性的ssrna，TLR8和TLR7一样，也是别外源性的病毒ssrna和内源性的ssrna，但也识别microrna。TLR9识别病毒或细菌cpg模块，或者自身的DNA。

Tlrs信号通路包括myd88依赖的和非依赖的。Myd88依赖的信号通路，配体结合到膜（TLR2/1、TLR2/6、TLR4/MD-2、和TLR5）上或胞内载体（TLR7、TLR8、TLR9）上之后，开始募集受体分子myd88到它们的TIR区域。TLR2/1、TLR2/6、TLR4/MD-2同时也募集myd88受体样蛋白MAL，这种蛋白也叫作TIR区域连接受体蛋白TIRAP。Myd88包含两个区域：TIR区域和死亡区域，其中TIR区域能够与tlrs的TIR区域相互作用。Myd88的死亡区域能够募集IRAK蛋白1、2、4，IRAK1、2、4能够进一步的募集TRAF6到受体符合物上。磷酸化的IRAK1和TRAF6然后离开受体在膜上形成复合物TAK1，TAB1和TAB2。TAK1，TAB1和TAB2能够诱导TAK1和TAB2的磷酸化。TAK1和TAB1磷酸化后，IRAK1在质膜上被降解。活化的TAK1调控IκB激酶（IKK）复合物，这一复合物包含两个激酶亚基（IKKα和IKKβ）。在正常的细胞中，IκB是结合在NF-κB上的，避免NF-κB入核。活化的IKK能够导致IκB的磷酸化，起始泛素化和蛋白降解，从而释放NF-κB入核^[1-3]。

Tlrs的激活可诱导很强的免疫应答反应，有利于机体抗病原微生物感染或组织损伤，但是过强的免疫反应也会带来不利影响，如产生内毒素休克、自身免疫性疾病等。稳态下，机体存tlrs的负反馈调节，适时终止tlrs信号，避免过强的免疫反应。具体可归结5种不同机制：可溶性的tlrs竞争相应的配体，如可溶性TLR4、TLR2通过跨膜负调节分子调节。利用细胞内的负调控分子，下调tlrs的表达。诱导tlrs信号过强细胞的凋亡^[4-6]。

天然免疫是最先也是最原始的抗病原的防线。许多对天然免疫的认识都来自对果蝇的研究。果蝇发育和细胞细胞生物学过程是高度保守的，这让他成为了一个很好的模型来研究哺乳动物的发育和疾病。而且，许多经典的信号通路包括免疫信号通路，最早都是利用基因筛选在果蝇中发现的。果蝇是十分强大的模型来研究哺乳动物的天然免疫。而且，果蝇能够被超过20种病毒12种病毒家族感染，而且这些病毒包含多种复制策略、趋向性以及致病机制。而且这些病毒中的许多类型同时也能够感染人类，或者作为研究人类疾病相关的模型。在遗传强大的系统的，例如果蝇，中研究病毒能够同时提供我们包括病毒特异性以及更多的致病机制和天然免疫的遗传观察。已经确定昆虫对病毒感染能够产生抗病毒过程，包括小RNA沉默途径，和大量的信号级联途径包括自噬。由于许多途径是保守的，许多新发现将有可能在脊椎动物的天然免疫中发挥基本的作用。

1.2凋亡调控途径

机体内细胞死亡的主要途径为细胞凋亡，细胞凋亡发生在机体发育的各个时期，对机体的发育起着十分重要的作用。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念，这一概率由后来的Paweletz等进行详细的描述^[7-9]。目前，发现真核细胞主要有三种途径的细胞凋亡，分别是线粒体途径（内源性途径），死亡受体途径和内质网途径。

1.2.1线粒体途径

也称内源性途径，包括两类：第一类是依赖Caspase的凋亡途径，第二类是不依赖Caspase的凋亡途径。依赖Caspase的凋亡途径：在凋亡诱导因子的刺激下，线粒体中的cytc即细胞色素C被释放到细胞质中，然后与凋亡蛋白酶活化因子1（Apoptosis protease activating factor1,Apaf-1）结合形成一个多聚体。这个形成的多聚体然后再进一步的与凋亡起始分子caspase-9结合从而形成凋亡小体，caspase-9被凋亡小体激活，再进一步激活其下游的凋亡执行分子即caspase-3，caspase-6和caspase-7，这些凋亡执行分子能够诱导细胞凋亡的级联反应。线粒体途径主要的观测指标是细胞色素C，在正常细胞内，细胞色素C一般是位于线粒体内的，但是如果细胞收到刺激从而处于凋亡状态，线粒体内的细胞色素C就会被释放出来，跑到细胞质当中。研究表明，细胞色素C从线粒体释放的细胞质中是通过Bcl-2家族完成的，Bcl-2家族蛋白能够调控线粒体膜的通透性，使线粒体膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP）^[10]。目前有三种模型来解释Bcl-2家族蛋白如何使线粒体膜透化，第一种认为，Bcl-2家族蛋白通过调控位于线粒体膜上的线粒体PTP（Permeability Transition Pore,渗透性转换孔）的闭合与开放从而调控线粒体膜透化。第二种模型认为，Bad、Bax等Bcl-2家族中的促凋亡蛋白能够使线粒体的外膜通道打开，从而使细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中。最后一种模型认为，凋亡过程中，一些外界的刺激改变了线粒体的状态，使线粒体的形态和活性都发生改变，从而诱导细胞色素C的释放。这三种模型都解释了细胞色素C为什么能够从线粒体中释放出去，但是细胞色素C从线粒体中进入细胞质中的具体过程仍然需要进一步的研究，这种跨膜运输的过程是否需要ATP的参与，是否需要通道蛋白的参与，这些通道蛋白是什么，第一种模型中的Bcl-2是如何调控线粒体膜透性转换孔的，这种调控是如何被激活的，都有什么因子参与激活Bcl-2，Bcl-2是如何识别线粒体膜透性转换孔的，这种识别是否是特异性的，这些问题任需要进一步的研究。

1.2.2死亡受体途径

也称外源性途径，该途径是由死亡受体，包括肿瘤坏死因子TNF，Fas等与FADD结合，从而激活凋亡途径。具体过程为死亡受体与FADD结合，激活的FADD能进一步激活caspase-8，活化的caspase-8进一步的激活caspase-3和 caspase-7，从而诱导凋亡，活化的caspase-8能够被iaps抑制从而抑制凋亡^[12]。线粒体途径中的caspase-9也能够被iaps抑制，但是凋亡过程中线粒体会释放Smac,Diablo，等物质，能够抑制iaps活性从而活化caspase-9，诱导凋亡发生^[11]。

1.2.3内质网途径

主要是由内质网引起的，错误折叠或未折叠的蛋白的增多能够引起内质网产生应激反应，过强的应激反应能够诱导细胞凋亡。此外内质网对钙离子敏感，能够调节钙离子浓度，如果胞内钙离子浓度失调，也会引起细胞凋亡。当内质网受到胁迫时，例如内质网中钙离子稳态受到破坏，或者内质网内未折叠或错误折叠的蛋白质大量积累，Bcl-2家族蛋白蛋白对凋亡的抑制作用就会减弱，可激活Caspase-12从而参与由内质网途径引发的细胞凋亡。而在线粒体途径或死亡受体途径中起作用的刺激因子就不能够引起Caspase-12的激活^[13]。

1.2.4caspase

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)。Caspase是一组存在于细胞质中结构上类似的蛋白酶。Caspase存在于真核细胞中，线虫中与其同源的有Ced-3，果蝇中与其同源的有Dronc(与casepase-9同源)和Drice(与caspase-3,caspase-7同源)。Caspase、Ced-3、Dronc、Drice都与凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。Caspase负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。起细胞凋亡执行者作用的是caspase3,6,7。各种Caspase都富含半胱氨酸，它们被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割。在正常的细胞内，每一种caspase都是以非活性状态存在的，这种非活性的caspase称作酶原（zymogen），它是酶的非活性前体，其肽链比有活性时长一些，将多出的部分切除，就转变成有活性的caspase。有两类Caspase，一类是起始者（initiators）,另一类是执行者（executioners）,起始Caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始Caspase对执行者Caspase进行切割并使之激活，被激活的执行者Caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。

1.2.5NF-KB途径抑制病毒感染

在哺乳动物中，病毒识别通过模式识别受体，例如TOLL样受体，TOLL样受体能够活化抗病毒信号过程。在果蝇中有两种模式识别受体TOLL和Imd，用来识别病原相关的分子模式。研究指出，病毒感染能够诱导包括Jak-STAT信号途径和TOLL通路的激活。TOLL通路能够被激活在感染Dengue的蚊子中。相反的，感染DCV的果蝇对TOLL通路并不敏感。所有的这些数据都显示，TOLL通路在一些抗病毒应答中起到一点的作用；然而，每一种病毒病原貌似都有不同的抗病毒途径。