摘 要

本文从土壤中筛选出产两株低温蛋白酶微生物菌株，然后用最常用的海藻酸钠载体将低温微生物固定化，并探索固定化低温菌对低温菌生长以及产酶情况的影响，由于固定化微生物技术在工业生产上具有发酵速率快、生产周期短、产品质量稳定、细胞可反复使用、易于实现连续化生产等优势，而且低温蛋白酶在食品、洗涤、化妆品和废物处理等工业上的拥有巨大应用前景，所以说本实验的研究具有重大的现实意义。

研究结果表明固定化后的低温菌生长良好，固定化后低温菌所产蛋白酶可以释放，调整不同的包埋条件时，固定化低温菌释放蛋白酶的酶活力有影响。固定化对菌所产的蛋白酶活力有影响。

本文最大的特色在于固定化产低温蛋白酶的低温菌，一直以来对固定化低温菌的报道文献较多，但是大多数都是在研究污水治理方面。低温蛋白酶应用广泛，同样值得大家去探索。

关键词：低温微生物；海藻酸钠；低温蛋白酶；固定化

Abstract

Cold-adapted strains of bacterium were isolated from soil and identified,which were capable of producing cold-adapted protease.Then encapsulated cold-adapted bacteria by using the commonly sodium alginate and explore the growth and the capable of producing protease.Because immobilized cells technology with a faster rate but a shorter fermentation period for stable quality, which can be easily applicated in continuous production,and cold-adapted protease in the food, washing, cosmetics and waste disposal industry has a great application prospect, so that it is of great realistic significance to the study of this experiment.

Research results show that the immobilized cold-adapted bacterium grew well,and can release protease from the microsphere,when adjusting different immobilized condition, the activity of the release protease various. Immobilization of strain influence the activity of protease.

The biggest feature of this paper is that we immobilized bacteria producing cold-adapted protease, immobilized cold-adapted bacterium has been reported more, but most of them are in the research on sewage treatment. But what I research now is new, and is also worthy of everyone to explore.

Key Words：Cold-adapted microorganisms；Sodium alginate；Cold-adapted protease；Immobilization.

目 录

第1章 绪论 5

1.1低温菌与低温蛋白酶 5

1.1.1低温菌 5

1.1.2低温蛋白酶 6

1.1.3 低温蛋白酶和低温菌的优点与缺陷 7

1.2固定化微生物技术的性质及其优缺点 8

1.2.1固定化生物技术的概述 8

1.2.2固定化方法 8

1.2.3微球凝胶材料的选择 8

1.2.4固定化微生物的优点与缺点 9

1.3研究目的、主要内容及研究意义 9

第2章 产低温蛋白酶耐冷菌株的筛选及鉴定。 10

2.1材料 10

2.1.1菌株来源 10

2.1.2培养基 10

2.2低温菌株的分离 11

2.2.1耐冷菌富集 11

2.2.2耐冷菌株初筛 11

2.2.3耐冷菌株温度复筛 11

2.2.4结果与讨论 11

2.3.产低温蛋白酶菌株的鉴定以及粗酶液部分酶学性质研究 12

2.3.1低温菌株的鉴定 12

2.3.2菌株培养和胞外蛋白酶提取 12

2.3.3粗酶液部分酶学性质研究 12

2.4菌株的形态鉴定 14

2.4.1（裸菌）SEM测试方法 14

2.5 小结 15

第3章 产低温蛋白酶耐冷菌株的固定化及其表征 16

3.1实验材料 16

3.1.1 培养基 16

3.1.2实验试剂 16

3.1.3 实验仪器 17

3.2实验方法 17

3.2.1菌种的活化及扩大培养 17

3.2.2耐冷菌的固定化微球的制备及显微镜、SEM观测 18

3.2.3固定化微球及裸菌的培养 18

3.2.4生长曲线的测定 18

3.2.5酶活力的测定 18

3.2.6耐pH以及耐温度的测定 19

3.3实验结果及分析 19

3.3.1微球制备观测结果 19

3.3.2 微球制备数据分析 20

3.3.3 LS4菌株的实验结果 21

3.3.4 LS4菌实验结果分析 24

3.3.5 LS3菌株的实验结果 24

3.3.5 LS3菌实验结果分析 27

3.4小结 27

第4章 结果与展望 28

4.1 实验结果 28

4.2 实验展望 28

参考文献 29

致 谢 31

第1章 绪论

1.1低温菌与低温蛋白酶

1.1.1低温菌

低温菌是极端微生物之一，并根据其生长温度特性分为嗜冷菌（Psychrophilies）和耐冷菌(Psychrotrophs) 两类，根据Morito的定义，嗜冷菌(Psychrophilies)必须生活在低温条件下，其最高生长温度不超过20℃，在0℃可生长繁殖的微生物；耐冷菌(Psychrotrophs)最高生长温度高于20℃，在0-5℃可生长繁殖的微生物[7] 。20世纪70年代以来，极端环境微生物已成为微生物学发展的新领域和新的资源库。

低温菌一般生存在低温环境，在地球生物圈中，有80%的地方常年平均温度在5℃或低于5℃，低温环境是整个生态系统中一个重要的组成部分，是由在一定低温条件下固态水即冰川、冰盖、积雪、海冰、河湖冰以及地下冰掺杂着多年冻土、季节冻土等组成的特殊生态系统[9]。所以低温微生物在地球上分布广泛，主要分布于海洋、极地环境、冰川、高山冻土等常冷环境。此外，还存在于常温土壤、人工湿地、河流底泥、低温生物膜、池塘等一般生境。