摘 要

四价硒有一定的毒性，是水环境中常见的污染物，但是硒是生命体所必须的微量单质。开发应用微生物还原四价硒至零价硒，可以达到回收单质硒的目的，具有非常重要的意义。本研究以M9和LB为培养基，运用分光光度计法测定四价硒含量，研究细菌菌株Y10和Y49还原四价硒的能力。优化pH、温度、起始浓度、碳源、通气条件等因子，获得两个细菌菌株还原四价硒的最佳条件。同时，测定9种金属离子对两个菌株还原四价硒的影响。结果表明，在培养基pH为7.0、温度为30℃、摇床转速为100 rpm、唯一碳源为蔗糖、初始亚硒酸盐浓度为2.0 mmol/L的条件下，两个菌株还原四价硒的能力都达到最强。在LB培养基中Y10还原亚硒酸盐的转化率为90.7%；Y49还原亚硒酸盐的转化率为94.05%；在M9培养基中Y10还原亚硒酸盐的转化率为92.5%；Y49还原亚硒酸盐的转化率为89.4%；在最佳条件下，金属离子Cu(II) 和Hg（II）对两个菌株的生长和四价硒的还原完全抑制，Ni（II）、Pb（II）、Cr（VI）、Cd（I）对菌株的生长和四价硒的还原有部分抑制的作用，但Zn（II）、Co（II）、As（III）对菌株的生长和四价硒的还原抑制效应不明显。

关键词：Y10、Y49、亚硒酸盐还原、单质硒、金属回收

Abstract

Selenium is toxic and common in water environments, but selenium is a trace element essential for life of the body. Development and application of microbial reduction of selenite to elemental selenium are of importance and can achieve the recycling elemental selenium. In this study, M9 and LB were used to for selenite reduction by two bacterial strains Y10 and Y49. The selenium concentration of selenite was determined by spectrophotometry method. pH of media, incubation temperature, initial concentration of selenite, carbon source, ventilation conditions and other factors was optimized in reduction of selenite by Y10 and Y49. The optimum conditions were obtained for two strains, that was pH 7.0, 30 ℃, rotation speed 100 rpm, sucrose as carbon source and initial selenite at 2 mmol/LIn LB broth, Y10 could reduce selenite from initial selenite 0.05 mM to final 0.045 mM, with a rate of reduction 90.7%; Y49 reduced initial 0.025 mM to final 0.047 mM, and the reduction rate was 94.05%. In M9 broth, Y10 could reduce selenite 0.023 mM (initial selenite as), with a rate of reduction 92.5%; Y49 reduced to 0.022 mM, and the reduction rate was 89.4%. At the same time, the influence of other metal ions on reduction of selenite by two strains was also determined. Under the optimized conditions, the metal ions Cu (II) and Hg(II) completely inhibited the cell growth and selenite reduction of tetravalent selenium, and Ni(II), Pb(II), Cr(VI), Cd (I)also showed partial inhibition, whereas Zn(II), Co(II), As(III) could not have obvious effects on the cell growth and selenite reduction.

Keyword : Y10, Y49, selenite reduction, selenium, metal recovery

目录

第1章 绪论 1

1.1 硒的种类与分布 1

1.2 硒的生物学意义 1

1.3 硒的还原及回收 1

1.3.1 传统处理方法 2

1.3.2 微生物修复 2

第2章 材料与方法 3

2.1 仪器与试剂 3

2.1.1 仪器 3

2.1.2 其它实验用具 4

2.1.3 化学试剂 4

2.1.4 培养基与试剂制备 5

灭菌 5

2.2 实验方法 5

2.2.1 实验菌株 5

2.2.2 菌株活化培养 5

2.2.3 不同初始pH值的菌株培养 6

2.2.4 不同温度对的菌株培养 6

2.2.5 不同通气条件的菌株培养 6

2.2.6 不同碳源的菌株培养 6

2.2.7 不同初始浓度的菌株培养 6

2.2.8 不同金属离子的菌株培养 7

2.2.9 分析方法 7

第3章 结果与分析 7

3.1 四价硒的标准曲线 7

3.2 pH值对还原硒的影响 8

3.3 温度对还原硒的影响 9

3.4 通气条件对还原硒的影响 11

3.5 碳源对还原硒的影响 13

3.6 初始硒浓度对还原硒的影响 15

3.7 金属离子对还原硒的影响 17

第4章 讨论 19

第5章 结论 21

致 谢 24

第1章 绪论

1.1 硒的种类与分布

硒在自然界中主要以无机态硒（一般指亚硒酸盐和硒酸盐）和有机化合态硒（以无机态硒为反应物经过生物反应并与氨基酸结合而成）^[10]。

硒在地球中分布广泛，其中地表土壤层、地表水层和海水浅层以及大气层是硒的主要分布场所。地表土壤层的硒主要集中在各类特殊的岩石和金属矿中，地表土壤层中的高硒地区的土壤中存在大量的沉积岩和金属矿复合物，而地表土壤层中的缺硒地区的土壤一般是一些火山岩，金属矿复合物和金属矿副产物很少^[3]。硒在海水中的含量与河水中的含量相比，差异不大。但是低硒地区与高硒地区相比，水中硒含量的差异却是相当大的。根基相关机构的统计，高硒地区的硒含量是低硒地区的500倍。水体中硒含量的差异之所以如此之大，是因为不同的地区的总体硒的含量差异很大。同时，由于存在气候条件、降雨量不同、水土流失严重不同、硒盐的价态也不同等多种因素影响，所以水中硒含量的差异是相当大的。大气层中也硒的存在，并且大气中的硒是植物获取微量元素硒的重要来源，同时大气层也是植物体与环境中的硒进行物质循环的主要场所。

1.2 硒的生物学意义

必需的微量单质对于我们身体的健康很重要。硒是是一种生命必需的微量单质元素，如果人体的摄入量不足可能会引发多种疾病。比如癌症、心脏病以及人体的衰老加快等病症都可能与人体本身硒的摄入量不足有关^[1]。经过许多实验研究表明，硒元素是生物体内多种酶的活性部位的重要辅酶或辅基，是酶的重要组成部分，在生物体的各种生命活动中起非常重要的生理功能和营养保健作用。

1.3 硒的还原及回收

随着科学技术的不断创新与发展，农业和工业的现代化发展取得了重大进步，同时不可避免的造成各种污染，特别是工业方面的污染更是导致植物体对硒盐的吸收利用严重不足，最终导致动物和我们人类对于硒的摄入量严重减少。此外，我国是一个严重缺硒的国家，根据相关资料显示，我国有72%地区缺硒，30%地区严重缺硒。经研究表明，亚硒酸盐和硒酸盐是硒存在的常见化学价态，硒酸盐易溶解于水中，但是亚硒酸盐在土壤中通常和常见金属的各种氧化态化合物紧密结合形成复杂的难溶于水的复合物，不易被植物的根茎吸收利用^[2]。通过本次研究，旨在研究优化菌株还原四价硒的pH、温度、起始浓度、碳源、通气条件等因子，从而能使菌株更高效还原四价硒，提高土壤中硒的生物利用率。

1.3.1 传统处理方法

即是用化学方法制备单质硒或硒元素，具体步骤如下：一、配制样品即浓度适宜的亚硒酸盐溶液；二、加入具有还原性的蛋白质或多肽或者具有还原性的酶试剂；三、加入化学还原试剂进行还原反应；四、四价硒被还原成单质硒并且形成红色颗粒，还原试剂能将 6价、 4价、0价硒还原成0价或-2价硒。

然而传统的化学方法还原亚硒酸盐产生红色单质硒的方法，不易操作，能源消耗大，单质硒的提取不易，而且容易造成二次污染，所以实用价值不大。因此，利用活性微生物对亚硒酸盐进行还原产生单质硒的新方法被人们广泛研究和运用，利用微生物来降解并回收利用金属离子的方法已经成为修复生态环境的新途径，前景广阔。

1.3.2 微生物修复

微生物修复是指在人为的参与下，利用从自然环境中分离获得的野生菌株或人为添加经过人工处理或基因工程处理的突变菌株对环境中的污染物进行氧化还原、降解、吸附和去除的方法。

用微生物来修复金属离子造成的污染主要是利用微生物的两种作用：一是通过微生物的吸附、生物反应代谢活动等来达到对金属离子的固定和净化作用；二是通过微生物对金属离子的胞内或胞外的氧化还原作用，改变金属离子价态，从而改变金属离子的化学形态，减少金属离子的危害^[4]。

研究表明，许多细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等，均可以将亚硒酸盐还原成红色的单质硒或硒元素或者纳米硒颗粒，同时将还原物分泌到细胞外形成硒-蛋白质复合体^[3]。因此，这些细菌在还原回收利用硒方面具有巨大的研究和应用潜力。多年以来，关于亚硒酸盐还原产生红色单质的微生物反应过程以及菌株还原亚硒酸盐转化形成硒元素的最佳还原条件，科学家们进行了大量的相关研究，2003年，Herbel 等发现Bacillus selenitireducens 在厌氧条件下可将亚硒酸盐（ 4）还原为单质硒（0）和硒化物（-2），证明了微生物能够将硒酸盐（ 6）和亚硒酸盐（ 4）还原成单质硒（0）和硒化物（-2），同时表明了某些特定的微生物确实能够将高价态硒盐还原成低价态单质硒和硒化物^[7]。

本研究主要通过微生物对亚硒酸盐进行还原。某些特定的微生物能够将高价金属离子还原成低价态的单质元素，并且进行还原回收利用^[17]。在一些特定的土壤中分布着许多可以将亚硒酸盐还原并转化为硒元素的微生物，这些微生物能将四价硒还原为红色单质硒，从而达到还原回收重新利用硒的目的^[15]。

第2章 材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器

用于实验的主要仪器见表2.1。

表2.1 实验用主要仪器

2.1.2 其它实验用具

烧杯，锥形瓶，量筒，接种环，酒精灯，容量瓶，玻璃棒，培养皿，移液枪及枪头等。

2.1.3 化学试剂

用于实验的化学试剂见表2.3。

表2.3 实验用化学试剂

2.1.4 培养基与试剂制备

LB培养基：