摘 要

生物膜（Biofilm，BF）是微生物黏附在基质上形成的膜层结构，其在细菌抵抗抗菌物质和宿主免疫成分的过程中发挥着极其重要的作用，因此降解生物膜是杀菌的重要步骤。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Dispersin B，DspB）是一种有望在医疗领域应用于抗生物膜上的糖苷水解酶。

本论文主要探讨一种新型的靶向的抗生物膜纳米复合材料——磁性纳米粒子固定化DspB。第一部分利用聚多巴胺与戊二醛对磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）进行修饰，并对其进行傅里叶变换红外（FTIR）、X射线衍射（XRD）、Zeta电位等表征，然后将DspB通过迈克尔加成反应、醛胺缩合反应分别固定在聚多巴胺修饰磁珠与醛基修饰磁珠上，并测定固定化酶的最适pH、最适温度、热稳定性与反应动力学。第二部分用制备的两种磁珠进行抗菌测试，以金黄色葡萄球菌作为实验对象，进行了共培养与水解生物膜实验，验证其抗菌性能。

研究结果表明制备的两种磁珠结构稳定，具有磁性纳米粒子的一般特性。两种磁性纳米粒子固定化DspB的最适温度为37 ℃，最适pH为6.0，热稳定性提高，亲和性增强，相较于游离酶更适于人体内应用。因为固定方式的不同导致两种固定化酶在固定量上有些许差异，但对金黄色葡萄球菌生物膜生长具有显著的抑制作用，对形成的生物膜也表现出较好的水解能力，具有潜在的研究及应用价值，为之后的抗菌材料提供了一种新思路。

关键词：DspB；固定化；抗生物膜；磁性纳米粒子

Abstract

Biofilm (BF) is a membrane structure formed by microorganisms adhering to a substrate. It plays an extremely important role in the process of bacteria resisting antibacterial substances and host immune components. Therefore, degradation of biofilm is an important step in sterilization. β-N-acetylglucosidase (Dispersin B, DspB) is a glycoside hydrolase that is expected to be applied to anti-biofilms in the medical field.

This thesis mainly discusses a new type of targeted anti-biofilm nanocomposite, magnetic nanoparticles immobilized DspB. In the first part, magnetic nanoparticles (MNPs) were modified with glutaraldehyde and polydopamine, and they were characterized by Fourier transform infrared (FTIR), X-ray diffraction (XRD), and Zeta potential. DspB was immobilized on polydopamine modified magnetic beads and aldehyde modified magnetic beads by Michael addition reaction and aldol condensation reaction, and the optimal pH, optimal temperature, thermal stability and reaction kinetics of the immobilized enzyme were determined. In the second part, the two kinds of magnetic beads prepared were used for antibacterial test. Staphylococcus aureus was used as the experimental object. Co-cμLture and hydrolyzed biofilm experiments were performed to verify the antibacterial performance.

The research results show that the prepared two kinds of magnetic beads are stable in structure and have the general characteristics of magnetic nanoparticles. The optimal temperature of the two magnetic nanoparticles immobilized DspB is 37 ℃, the optimal pH is 6.0, the thermal stability is improved, the affinity is enhanced, and it is more suitable for human body application than free enzyme. Due to the different immobilization methods, there is a slight difference in the amount of immobilization of the two immobilized enzymes, but it has a significant inhibitory effect on the growth of the Staphylococcus aureus biofilm, and also shows better degradation ability for the biofilm formed The potential research and application value provides a new idea for the antibacterial materials in the future.

Key Words：DspB; immobilized enzyme; anti-biofilm; magnetic nanoparticles

目录

第1章 绪论 1

1.1 生物膜 1

1.1.1 生物膜简述 1

1.1.2 细菌生物膜的形成 1

1.1.3细菌生物膜的结构 1

1.1.4 细菌生物膜的控制 2

1.2 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 2

1.2.1 DspB简述 2

1.2.2 DspB应用 3

1.2.3 DspB固定化 4

1.3 磁性纳米粒子 4

1.3.1 磁性纳米粒子简述 4

1.3.2 磁性纳米粒子在抗菌方面的研究 4

1.3.3 磁性纳米粒子固定化酶 5

1.4 研究的目的、内容及意义 5

1.4.1 本研究的目的 5

1.4.2 本研究的主要内容 6

1.4.3 本研究的意义 6

第2章 核壳结构磁珠的制备与表征 7

2.1引言 7

2.2 实验部分 7

2.2.1 实验材料 7

2.2.2 实验仪器 7

2.2.3 Fe₃O₄ MNPs的合成及二氧化硅修饰 8

2.2.4 聚多巴胺磁珠的制备 8

2.2.5 醛基磁珠的制备 8

2.3 测试与表征 9

2.3.1 傅里叶变换红外光谱（FTIR）测定 9

2.3.2 X射线衍射（XRD）分析 9

2.3.3 Zeta电位测定 9

2.4 结果分析 9

2.4.1 FTIR分析 9

2.4.2 XRD分析 10

2.4.3 Zeta电位分析 10

2.5 本章小结 11

第3章 固定化DspB的制备与酶活测定 12

3.1引言 12

3.2 实验部分 12

3.2.1 实验材料 12

3.2.2 实验仪器 13

3.2.3 固定化酶的制备 13

3.2.4 最适温度的测定 14

3.2.5 最适pH的测定 14

3.2.6 温度耐受的测定 14

3.2.7 反应动力学的测定 14

3.3 结果分析 15

3.3.1 最适温度 15

3.3.2 最适pH 15

3.3.3 温度耐受 15

3.3.4 反应动力学 15

3.4 本章小结 16

第4章 影响生物膜能力 17

4.1 引言 17

4.2 实验部分 17

4.2.1 实验材料 17

4.2.2 实验仪器 18

4.2.3 结晶紫染色法 19

4.2.4 共培养实验 19

4.2.5 水解生物膜实验 19

4.3 结果分析 19

4.3.1 共培养 19

4.3.2 水解生物膜 20

4.4 本章小结 21

第5章 结论与展望 22

5.1 结论 22

5.2 展望 22

参考文献 24

致 谢 26

第1章 绪论

1.1 生物膜

1.1.1 生物膜简述

生物膜是微生物在漫长的进化过程中产生的适应环境和提高自身生存力的特殊膜层结构^[1]，其在细菌抵抗抗菌物质和宿主免疫成分的过程中发挥着极其重要的作用。细菌生物膜（Bacterial biofilm，BBF）是由细菌细胞以及包裹着细菌的胞外基质（ExtracellμLar polymeric substances，EPS）共同组成的结构性细菌群落^[2]。

细菌生物膜的概念首次由Costerton^[3]在20世纪70年代时提出。在之后的研究^[2-4]中人们逐渐发现从下水道的生物腐蚀到食品输送设备的污染，从轮船底部油漆的脱落到医用植入体的感染和细菌性松动，无一不充斥着细菌生物膜的身影。从医疗领域来讲，任何未完全消毒的区域都有可能形成细菌生物膜，并且人类的大多数慢性感染，包括口腔、肺和植入体相关感染，都和生物膜有关^[5]。虽然大多数情况下生物膜都处于人类的对立面，不过一些食品发酵与污染物的处理过程也有对细菌生物膜的利用。

1.1.2 细菌生物膜的形成