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从工业废水中分离的嗜水气单胞菌产生含三苯甲烷类染料的合成废水的生物修复和解毒

摘要：修复不同行业的染料废水需要经济和生物友好的方法。在这项研究中，一个新的能脱色三苯甲烷类染料的细菌菌株是从希腊的一个纺织污水处理厂分离得到的。分离的细菌鉴定为嗜水气单胞菌，测试表明在24h内脱色三苯甲烷类染料脱色率为72%至96%。该菌脱色效率是一个操作参数的功能（通风、染料浓度、温度和pH值），染料脱色的最佳操作条件为：pH值7-8，35◦C，培养基搅拌。24h内有效脱色的最大染料浓度为50mg/L。染料脱色用扫描型紫外可见分光光度计监测，表明脱色是由于染料降解成无色中间体。药害的研究以小麦、大麦和滨豆进行，揭示了三苯甲烷类染料产生在监测植物生长参数上的毒性作用。然而，随着脱色染料代谢物毒性显著降低，因此，说明三苯甲烷类染料由嗜水气单胞菌降解。

1引言

在全球范围内，由于对纺织产品的需求以及合成染料的生产和应用的比例增加，染料废水已成为严重污染问题的主要来源之一。据估计，每年全世界超过10000种不同的染料和颜料用于工业，生产70万吨以上的合成染料。在纺织工业中，染色和整理操作过程中，由于染色效率低下，每年都有多达200000吨的染料流失到废水中。不幸的是，大多数这些染料用传统污水处理工艺无效，且由于它们对光、温、水、洗涤剂、化学物的稳定性高，抗微生物的攻击，染料容易留在环境中。尽管如此，由于环境立法染料进入水体之前需要处理，工厂需要消除废水中含有染料的颜色。

许多不同的合成染料中，三芳基甲烷（又称三苯甲烷）染料在纺织行业中是最常用的染料之一。它们的使用量约占染料总消费量的30%至40%，并广泛用于尼龙、棉花、羊毛和丝绸。他们也用于食品着色、油、油脂、蜡、油漆、化妆品、纸张、皮革、塑料以及在细菌学和组织病理学方法中的标本染色。由于染料着色值普遍较高，水中染料少于1ppm即可产生明显的着色，这些染料的广泛使用，导致大量有色废水，由于降低光穿透可能会影响水体中的气体溶解度，并显着降低水生生物的光合活性。除了视觉效果，三苯甲烷类染料一般被认为是有毒和致癌的或由其他已知的致癌物质制备的。一些报告还表明，纺织染料和废水对植物有毒害作用，而植物具有重要的生态功能，如提供野生动物的栖息地，保护土壤免受侵蚀，并提供非常重要的土壤肥力—有机物质，因此，有必要制定有效的处理策略，去除染料废水的颜色。

各种物理化学方法，如活性炭吸附、凝聚、絮凝、浮选、离子交换、膜过滤、臭氧氧化、反渗透已用于染料废水脱色。然而，这些方法是低效的，昂贵的，适用性有限，并产生难以处置的废料。相反，生物过程染料废水的处理提供了一种低成本，环境友好，高效的选择。

生物脱色可能通过在两种途径发生：通过微生物量吸附（吸附）或细胞生物降解。生物吸附是吸附剂基质的染料包封（微生物），无污染物的破坏，而生物降解是原染料结构分散成更小的化合物，导致合成染料的脱色。一些研究人员描述了利用微生物作为生物吸附剂去除废水中的污染物。然而，由于微生物操作的易用性和灵活的适应能力要到给定的条件，生物降解机制对染料废水的吸附比较有效。在过去的几十年中，分离出了许多微生物，其特征是降解各种合成染料，但大多数的报告主要处理偶氮染料的脱色。尽管纺织行业使用增加，关于微生物系统三苯甲烷类染料降解和解毒信息仍缺乏。因此，能降解和解毒三苯甲烷类染料的有效物种的分离在染料废水处理的生物技术方面很重要。

在这项研究中，一个细菌株，嗜水气单胞菌（能够脱色三苯甲烷类染料），使用选择性富集方法从纺织工业废水中分离，就各种参数（如培养基搅拌，初始染料浓度，pH值和温度）对细菌菌株的染料脱色的影响进行了调查，脱色后形成产品的毒性测定用植物试验。

2材料和方法

2.1化学品

本研究中使用的三芳基甲烷染料（Basic violet 14，Basic violet 3和Acid blue 90）从Sigma Chemical Co.（St.Louis，Mo，USA）购买。所用染料的化学结构和特性描述于表1。通过膜过滤制备每种染料的储备溶液。所有其他使用的化学品均为分析纯。

2.2细菌和生长培养基

使用的细菌菌株从染料废水中分离，所述染料废水得自希腊的萨洛尼卡纺织公司（Textile of Thessaloniki，SA，Greece）。在基础紫3作为碳源的合成废水培养基（SWM）中采用了连续选择性富集分批培养选择染料脱色细菌的原理，合成废水培养基的基本组成为（g/L）：（NH4）₂SO₄ 0.28，NH₄Cl 0.23，KH₂PO₄ 0.067，MgSO₄·7H₂O 0.04，CaCl₂·2H₂O 0.022，FeCl₃·6H₂O 0.005，NaCl 0.15，NaHCO₃ 1.0 ，1 mL/L的微量元素溶液含有（g/L）：ZnSO₄·7H₂O 0.01，MnCl₂·4H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.392，CoCl₂·6H₂O 0.248，NaB₄O₇·10H₂O 0.777，NiCl₂·6H₂O 0.02。用于染料脱色细菌分离的纺织废水适应环境持续8周，然后转移到含有100mL SWM的250mL锥形瓶中。锥形瓶培养后，将显示快速和稳定的脱色活性的混合培养物转移至新制备的SWM。连续5次转移后，将其接种在含有20mg/L的每种染料的SWM琼脂上，并在30℃温育5天。进一步研究发现，细菌菌落周围的透明区域迅速扩大，其命名为TTW 1-5。为了检查每种细菌分离物脱色染料的潜力，使用含有100mu;L掺有染料的SWM的无菌250mL锥形瓶进行初步处理，之后用新鲜生长的细菌细胞接种溶液。最终pH为7.2,选择显示最高的降解三芳基甲烷染料能力的细菌分离物用于随后的研究。使用革兰氏染色，孢子测试，运动性测试和一系列生物化学和生理学测试（表2）来表征和鉴定所选择的细菌（TTW4），如Vanderzannt和Splittstoesser和Cheesbrough所述，并且参考Bergeys确定性细菌学手册。

2.3批量脱色操作

在250mL锥形瓶中以分批模式研究三芳基甲烷染料的脱色，烧瓶含有100 mL的SWM和细菌生物质。每个烧瓶用2 mL新鲜生长的嗜水气单胞菌接种。接种量在光密度为1.0，lambda;= 620 nm（1.50times;10 ⁷细胞/ mL）的条件下进行调整，并在30℃下振荡（150 rpm）和静态条件下孵育，其他（1-100 mg/L），温度（15 ℃-45 ℃）和初始pH（4-10）在摇动孵育条件下进行批次脱色实验。然后，在随后的实验中，在摇动条件下以35 ℃和pH7和初始染料浓度为50 mg/L的最佳条件。使用三种类型的对照：未接种的无菌对照，热杀死对照和叠氮化钠（0.1％w/v）修正对照。首先指示中间成分对脱色的影响，后两种显示染料在细胞上的吸附。孵育后，取等分试样（5 mL）并在10,000 rpm离心15分钟以分离细菌沉淀并获得澄清的上清液，其用于测量培养物样品在使用扫描分光光度计（Shimadzu UV-2401PC型号Kyoto，Japan）测定各染料的最大吸收波长（lambda;max）。然后从染料浓度对为每种染料制备的吸光度的校准曲线获得样品的残余染料浓度。通过使用吸附（A）和活性生物质（R）的染料去除来测定脱色活性，根据以下公式计算：

A(%)=[(C0-C1)/C0] times; 100%,

R(%)=[(C0-C1L)/C0] times; 100%,

其中C0-对照样品中染料的浓度（mg /L），C1- 具有杀死或叠氮化钠处理的细胞的培养物样品中染料的残留浓度（mg/L），C1L-残留浓度（mg /L）的染料。 使用铺板法在培养物样品10倍系列稀释后，在平板计数琼脂（Merck）上进行培养物中的细菌计数的计数。在35 ℃下孵育24小时后获得的活细胞计数表示为每mL的集落形成单位（CFU/mL）。

2.4.毒性研究

用50mg/L的每种染料及其提取的代谢产物进行植物毒性研究，使用小麦（Triticum aestivum），Hordeum vulgare和Lens esculenta的种子作为对照。将在乙酸乙酯中提取的每种染料的降解代谢物干燥并溶解在水中，形成50mg/L的最终浓度用于植物毒性研究。用1.2％次氯酸钠溶液对种子进行表面消毒以阻止真菌生长。将每种植物的6个种子分别置于每个培养皿中，并分别用每种染料及其降解产物的5 mL样品每天浇灌。将培养皿保存在黑暗中并观察发芽。具有胚根（gt;1mm）的种子被认为是发芽的。然后将发芽的种子分别暴露于10/14 h的昼夜循环长度温度范围约28plusmn;2 ℃。7天后记录胚芽（芽）和根（根）的长度和发芽率（％）。

2.5统计分析

所呈现的数据是从三次独立实验获得的三次重复（plusmn;SE）的平均值。使用方差分析（ANOVA），使用Dunett事后检验来检查数据，以检查因子之间的交互作用。显着性水平设定为5％。

3结果与讨论

3.1染色降解细菌的分离

挑取在加有碱性紫3的SWM琼脂上显示染料脱色电位的五种细菌分离物，并筛选它们降解三种三芳基甲烷染料（碱性紫14，碱性紫3和酸性蓝90）的能力。细菌分离物在24小时内使三种染料脱色，尽管脱色程度不同（表3），并且在36小时后获得由分离物进一步脱色的染料的变化分离物，脱色效率可归因于染料的化学结构的差异和不同细菌的不同代谢功能分离。发现染料被分离物脱色是由于降解，比吸附程度更大，因为与活细胞的染料百分比的减少相比，获得的吸附百分比相当低。分离TTW 4在24小时后没有显示任何吸附迹象。吸附和降解是微生物脱色染料的两种机制。染料吸附从细菌生长的检查来看明显的，因为那些吸附染料的细胞是深色的，而导致降解的那些将保持无色。虽然用染料培养8小时的分离的TTW4细胞是有色的，但没有一种细胞在温育和脱色24小时后被测试的染料中的任何一种着色。在用染料温育24小时后，细胞沉淀的丁醇提取物的脱色测定显示染料未吸附到细胞（数据未显示）。这表明染料的脱色主要是由于降解而不是细胞吸附。在8小时后深色的细胞垫可以解释为以下事实：在将染料输送到细胞质中之前，吸附通常是生物降解过程的第一步骤，并且其最终被活的微生物细胞分解。然而，大多数时间的吸附水平是生物转化效率或其不存在的指示，因为快速染料生物降解剂在脱色和孵育较长时间段时很少显示高吸附速率。在使用活的，高压灭菌的（杀死的）和代谢中毒的分离株TTW 4的细胞进行的另一个实验中，对于死亡和中毒的细胞，染料脱色低于4.5％，而活细胞显示从54％-78％ 4）。因此，活细胞显示的颜色去除归因于这些染料通过细菌的代谢功能的生物转化。在此之前，各种作者报道了基因的分离（tmr）编码酶，三苯甲烷还原酶（TpmD），从细菌，我们认为这种酶可能负责的染料测试的生物转化。杀死和中毒的细胞的生物量颜色的视觉变化及其在甲醇中的再悬浮显示，观察到它们的培养基的轻微脱色是由于染料吸附在细菌细胞上。死细胞的脱色（吸附）可能是由于在高压灭菌过程中破裂的细胞壁面积的增加，并且还可归因于细胞壁上的特定位点的暴露。基于结果，分离被鉴定为嗜水气单胞菌的TTW4被选择为具有最好的染料脱色电位，因为它显示出三种染料很少或没有吸附，并且在24小时内显示染料的快速脱色。因此，TTW 4被认为是有效生物处理纺织废水的良好候选物，并用于进一步研究。

3.2搅拌对脱色的影响

分离物，A.只有当在振动条件下孵育时显示有效的脱色活性，而在静态条件下获得了三种染料的差的脱色（lt;30％）（图1）。在搅拌条件下，在孵育24小时内，染料的脱色百分比分别为碱性紫14，碱性紫3和酸性蓝90的90％，75％和66％。在搅拌条件下孵育对于在静态条件下孵育更好的细胞生长也是必需的（数据未显示）。在静态条件下获得的染料的差的脱色可能归因于三芳基甲烷部分的氧化分解所需的氧的限制，因为当静态培养时获得增强的脱色随后在搅拌条件下孵育。当0.02％（w/v）酵母提取物，淀粉或其他碳时，亲水亲水素也显示染料的最大脱色在培养基中补充来源（数据未显示）。在不存在共底物的情况下，细菌培养物显示降低的脱色速率，这表明可能用于产生NADH分子的补充碳源的可用性似乎对染料的生长和脱色是必需的。先前的报告已经显示NADH/NADPH和分子氧对于酶TpmD脱色三苯基甲烷染料是必需的，这表明酶是NADH/NADPH依赖性加氧酶。纺织工业废水通常含有上浆剂，例如淀粉，聚乙烯醇（PVA）和加入的羧甲基纤维素在施胶期间为纤维提供强度并使断裂最小化，并且这些物质可以在用于产生NADH分子的流出物处理期间用作细菌的辅助底物。

3.3.初始染料浓度对脱色的影响

在各染料的各种增加的初始浓度（1-100 mg/L）下研究染料的脱色。所得结果显示在24小时内初始浓度在1和20 mg/L之间的染料完全脱色（图2）。然而，在浓度以上时染料浓度增加，脱色百分比减少20 mg/L。在50 mg/L初始染料浓度下分别对于碱性紫14，碱性紫3和酸性蓝90获得90,78和65的脱色百分比，这表明可以用A实现可接受的高颜色除去。在培养肉汤中染色浓度低于50 mg/L。对于工业应用，重要的是知道使染料脱色的微生物是否能够承受高浓度的化合物，因为在典型的工业废水中的染料浓度可以在10和50 mg/L之间变化。嗜水气单胞菌可以以高于废水中所报道的浓度使染料脱色，因此可以成功地用于处理含染料工业废水。 Zabl

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