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识别和分析卡诺拉油菜中的MKK和MPK基因家族

摘要

背景：通过三种可逆磷酸化的激酶的激活的防御基因表达使真核促分裂原活化蛋白激酶（MAPK/MPK）进行信号级联转导和放大环境信号。

卡诺拉（油菜，甘蓝型油菜）是温带地区的主要作物。识别与表征卡诺拉MAPK和MAPK激酶（MAPKK/MKK）将有助于阐明他们在面临来自于环境中生物和非生物的压力做出的应答中所承担的角色。

结果：我们描述了对来自卡诺拉的7个MKK（BnaMKK）和12个MPK（BnaMPK）的成员的识别和分析。通过对已预测的BnaMKKs和BnaMPKs的氨基酸序列进行序列比对和系统发育分析，将它们划分为四个不同的组。我们也利用绿色荧光蛋白（GFP）分别考察了这四个组的亚细胞定位以及BnaMKK和BnaMPK基因家族的两个成员，并在细胞核和细胞质中同时检测到GFP信号。此外，我们在通过酵母双杂交（Y2H）系统分析BnaMKKs和BnaMPKs之间、以及BnaMPK和BnaWRKY之间的相互作用时发现了一些有趣的相互作用对。我们定义了相邻信号模块，包括BnaMKK9-BnaMPK1/2-BnaWRKY53，BnaMKK2/4/5-BnaMPK3/6-BnaWRKY20/26和BnaMKK9-BnaMPK5/9/19/20。在它们之中，有一些相互作用都未曾在之前的任何物种中有过相关描述。所选的相互作用是由双分子荧光互补在进行体内验证（附设）检测。卡诺拉MKK和MPK基因的一个子集的转录应答去刺激包括真菌病原体、激素和非生物胁迫是通过实时RT-PCR进行分析的，我们确定了几个BnaMKKs和BnaMPKs对水杨酸（SA），草酸（OA），核盘菌或其他环境压力的应答。比较卡诺拉和拟南芥推定同源基因的表达模式表明，转录表达模式普遍保守，只是具有一定子功能化差异的暗示。

结论：我们确定了来自卡诺拉7个 MKK和12个 MPK基因，并检测了他们的系统发育关系，转录表达模式，亚细胞定位和蛋白质-蛋白质相互作用。发现并非所有的表达模式和相互作用在卡诺拉和拟南芥之间都是保守的，突出了从模式生物来推断相关作物的局限性。这里介绍的数据提供了对卡诺拉中MKK-MPK-WRKY信号组件的第一次系统描述，也将进一步改善我们对防御应答的理解以及提供了对未来的作物改良的基础。

关键词：非生物胁迫；生物胁迫；欧洲油菜；MKK；MPK；油菜菌核病；WRKY

背景

环境压力包括盐度，极端温度，有限的可利用水资源和真菌病原菌深深限制农业生产力。缓解这些问题和确保可持续农业发展是植物生物学家考虑的一个优先事项。在它们的发展过程中，植物已经获得一个复杂的防御系统对不利的环境条件进行应答。包括三组蛋白激酶：MAPKK激酶（MAPKKKs，MAP3Ks，或MEKKs），MAPK激酶（MAPKKs，MAP2Ks，MKK或MEKS）和MAPK/MPKs组成的有丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK/MPK）级联，通过进化发展和连续的信号传导在真核生物中是保守的，该过程是通过磷酸化去扩增、传输和整合来自于细胞环境的信息到转录应答和代谢反应中心。

在拟南芥中，有80个MAPKKK，10个MKK和20个MPK基因。拟南芥中的10个MKK基因可以激活不同的MPKs，因此可能整合不同的信号通路的串扰。基于S/TxxxxxS/T共同结构域和“D位点”，可将MKKs分为四个主要的类别（A，B，C和D）。AtMKK1，-2，-4和-5已经被报道在植物胁迫的反应应答中起作用。该MPK家庭也有四个主要的类别（A，B，C和D）基于它们保守的T-D/E-Y基序以及A组、B组和C组包含T-E-Y基序而D组包含T-D-Y基序。分别在A组和B组的拟南芥MPK3，-4和-6都参与了许多不同的过程包括发育过程和应激反应。

WRKY转录因子（TFs）是重要的转录调节因子能够调节免疫应答和非生物胁迫[13]。越来越多的证据表明I组的WRKY转录因子，在它们的N端区域包含一个保守的SP簇和/或D结构域基序，可以通过依赖于MAPK的磷酸化被激活，这表明了WRKY的转录因子的翻译后调节 [14]。到目前为止，一些MAPKKK-MKK-MPK和MP​​K-WRKY模块和它们的功能已经被充分研究。例如，拟南芥MPK4的磷酸化是由上游的MKK1/2和MEKK1激活，一旦磷酸化，它会磷酸化和激活MAP激酶4的底物1（MKS1），然后触发灭活的MPK4-MKS1-WRKY33的形式解离并释放MKS1-WRKY33 [12,15-18]，释放的MKS1-WRKY33可然后进入细胞核内启动转录下游PHYTOALEXIN DEFICIENT3（PAD3），需要抗菌剂camalexin的产生[12,18]。另一方面，AtMPK3和-6由上游的MKK4和-5激活，并使WRKY33磷酸化以及通过植保素的生物合成基因PAD2和PAD3的转录调控，获得了对真菌病原体的抗性[19]。最近的一个报告提供的直接证据表明，AtWRKY33在体内通过AtMPK3磷酸化以应答灰葡萄孢菌的感染[20]，表明通过MPKs进行WRKY转录因子的磷酸化可能是将信号传导到细胞核的一个重要手段。

组成型活性AtMPK4（CA-MPK4）的表达减少SA积累和对来自番茄的丁香假单胞菌菌株（Pst DC3000）防御抗性 [21]。此外，在CA-MPK4植物在中，病原体相关分子模式（PAMP）触发的活性氧（ROS）也会被抑制，这与MPK4或丧失功能的MPK4突变体的调控效应是不同的[21]。拟南芥MEK1-MPK6还参与了在种子萌发过程中脱落酸（ABA）和和糖分信号的传递，如在双突变体MEK1 / MPK6中由糖分诱导的NCED3和ABA2会被废除 [22]。在植物对于灰霉病菌的免疫应答中， AtMPK3 / 6-AtWRKY33调节1-氨基-环丙烷-1-羧酸合酶（ACS）的活性，它的限速步骤是乙烯的生物合成途径，在转录水平和蛋白质的稳定性水平中 [23]。 AtMPK3和-6也参与气孔动力学和发展[24]。由于干旱和其他压力导致气孔关闭是由植物激素脱落酸ABA和H₂O₂介导的，该过程也需要AtMKK1和AtMPK3和-6的参与 [25]。 AtMKK3可能在C组MPK（MPK1，-2，-7和-14）的上游作用，去调节下游病理学相关（PR）基因，因为ProPR1 :: GUS基因的表达被AtMKK3 / AtMPK7的共表达而增强。当被敲除的mkk3基因易受Pst DC3000的影响时，AtMKK3的过度表达以及PR基因表达是可以承受的 [26]。

MAPK信号级联也已经被报道在其他植物物种起重要的作用。从一个来自水稻的MAPK（Oryza sativa），BWMK1，可以磷酸化一个转录因子，OsEREBP1。在对病原体抗性增强的条件下，烟草中过度表达的BWMK1增强了许多病原体相关基因的表达[27]。OsMAPK5受不同的生物（病原体感染）和非生物（伤口，干旱，高盐和冷冻）压力的诱导;然而，过度表达或RNA干扰介导的抑制作用证明OsMAPK5能够正调节抗旱，抗盐和抗寒性，同时负调节PR基因的表达和对真菌（稻瘟病菌）及细菌（水稻细菌性谷枯病菌）病原体的抗性[28]。最近的一个报告显示，OsMKK6能磷酸化OsMPK3，这些构成一个适度的（12°C），但不严重（4℃）低温信号传导途径[29]。在本氏烟和烟草中，SA诱导的蛋白激酶（SIPK）和伤口诱导的蛋白激酶（WIPK）是众所周知的参与渗透压，创伤，以及生物胁迫的应激反应[30,31]。在玉米中，ZmMPK3和-5被报道参与了植物对寒冷，干旱，紫外线和氧化的应激反应[32,33]。在小麦中，在相容的疾病相互作用中TaMPK3和-6分别在多层次进行调控[34]。在番茄和秘鲁番茄中，LeMPK1和LeMPK2在对系统素、四个不同的低聚糖诱导子（OES）和UV-B辐射的应答中被激活 [35]。在紫花苜蓿中，SimK的，MMK2，MMK3和SAMK被过量的铜或镉离子激活。此外，SimK也可被SimK激酶（SIMKK）激活。但是，也仍有许多未知MAPKKK-MKK-MPK模块等待被鉴定和表征[36]。到目前为止，还没有关于甘蓝型油菜的MAPKK / MKK和MAPK/MPK基因家族的系统调查的报道。

卡诺拉（油菜，甘蓝型油菜）是温带地区的一个主要的油料作物，其质量和数量经常受不利的环境压力包括真菌病原体的限制。由S.病菌de Bary引起的真菌病毒，是卡诺拉一个尤为突出的问题。由于缺乏抗性种系的胚浆，以及该抗性可能由多基因控制的事实，有必要确定和探讨有助于植物抵抗S.病菌的基因[38-42]。在我们以前研究的感染了S.病菌的卡诺拉转录中，我们确定了一些WRKY基因和MPK3，-4，-6和-17，以及一些MKK和MAPKKK是对S.病菌的感染进行响应[43]。另外，从卡诺拉中，我们确定了46个和克隆的38个 WRKY基因并对它们进行了研究[44]。然而大多数卡诺拉的MKK和MPK基因，除了MPK4的生物学意义和功能到目前为止尚未在欧洲油菜中有所描述。在目前的研究中，我们描述了鉴定和克隆7个 BnaMKK基因和12 个BnaMPK基因并使用生物信息学和分子以及生物化学检测分析了他们。我们发现，有一些BnaMKK和BnaMPK的基因对多种环境胁迫包容S.病菌，草酸（OA），干旱等有响应。通过酵母双杂交（Y2H）测定，对BnaMKK-BnaMPK和BnaMPK-BnaWRKY的相互作用进行了筛选以及对几个有趣的MAPK模块进行了鉴定。最后，比较卡诺拉和拟南芥推定同源基因的表达模式表明它们可能涉及不同的信号传递通路。通过这项工作，我们可以更好地理解生物（防御）和非生物胁迫应答还有在卡诺拉中通过MKK-MPK-WRKY模块调节的分子代谢。这里给出的数据也将为提高canola通过调节这些基因的表达水平对S.病菌以及一些其他的非生物压力的抗性奠定一个坚实的基础。

结果与讨论：

1、在卡诺拉中对BnaMKK基因和BnaMPK基因的识别和克隆

作为了解MKK和MPK信号级联反应在卡诺拉对非生物和生物胁迫的应答中所扮演角色的第一步，我们的目的是克隆来自于卡诺拉的BnaMKK基因和BnaMPK基因。由于甘蓝型油菜的基因组测序还没有完成而拟南芥是甘蓝型油菜的近亲，我们使用了拟南芥的10个MKK基因和20个MPK基因进行查询，在NCBI中进行了甘蓝型油菜的表达序列标签（EST）数据的BLAST搜索，数据库（重租赁110101）B.在NCBI油菜。结果，我们确定了MPKs的373个EST和MKKs的58个EST（表1，附加文件1：表S1），由于e值小于10^-4，这表明了显著的相似性。这些EST序列是手动进行，然后通过组装获得重叠群和单一序列，随后再对拟南芥转录数据库，TAIR10（http://www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp）相互进行BLAST搜索来

鉴定推定的直系同源基因。卡诺拉MKK基因和MPK基因的名称是基于分配到的推定同源的拟南芥的名称。此后，每个重叠群或单一序列的氨基酸通过采用DNAMAN或DNASTAR程序被预测。结果，我们成功地确定了8个BnaMKK基因的EST以及18 个BnaMPK基因（表1，其他文件1：表S1）。为了帮助表征这两个基因家族，我们为每个基因命名一个三个字母的代码，以BNA（甘蓝型油菜）作为开始，其次是家族名称（MKK或MPK），最后一个号码与拟南芥MAPK和MAPKK命名法（表1）一致。

我们用RT-PCR（逆转录PCR）和RACE（快速扩增cDNA末端）去克隆BnaMKK基因和BnaMPK基因的cDNA序列，并采用高保真聚合酶。其结果是，7个BnaMKK基因和12 BnaMPK

基因被克隆，并且序列保存于基因库（表1）。来自不同物种的直系同源物种可能具有相似的生物学功能[45]。由于一些MKK基因和MPK基因功能在模式植物拟南芥和水稻都得到了很好的研究，我们将我们克隆的BnaMKK和BnaMPK序列与拟南芥和水稻进行了对比，并且鉴定了每个物种推定的直系同源序列（表1）。

2、BnaMKKs和BnaMPKs的系统发育分析，多重序列比对和结构域分析

为了更好地理解MKK和MPK基因家族两者的进化史，我们也从代表主要陆生植物谱系各种物种中检索了MKK和MPK基因序列，包括苔藓植物小立碗藓（Pp），嫌盐植物江南卷柏（SM），和几个单-和被子植物，即：真双子叶植物拟南芥（At），葡萄（Vv），胡杨毛果（Pt）和大豆（GM）;以及单子叶植物水稻（Os），高粱（Sb），二穗短柄草（Bd）和玉米（Zm）。 通过在Phytozome v9.0搜索绿色藻类莱茵衣藻（Cr）的基因组，我们还确定了2个 MKK的基因，它的蛋白质序列分别表现了与AtMKK3和AtMKK6（附加文件2：表S2）极大的相似性。此外，我们还确定了来自海洋中的绿色藻类海洋微藻（Ot）的MKK基因，这是迄今世界上已知的最小的自由生活的真核生物[46]。应该指出的是，基于来自ESTs的证据，卡诺拉MKK蛋白家族的大小大致相当于拟南芥，水稻或杨树，虽然并非所有的卡诺拉MKK基因已经被克隆。在另一方面，绿藻和较低的陆生植物肾叶白头翁和江南卷柏相对于开花植物很明显进化了MKKs较小的组，这表明MKK基因家族在与另一个谱系的开花植物分化后有一个膨胀的过程。

从21个物种中收集的MKKs的氨基酸序列中，与我们的BnaMKK序列一起，通过使用最大简约法 (MP) （图1，附件3：图S1）工具构建一个系统发育树。OtMKK被用来当作树根， 由树的拓扑结构所示，来自不同物种的MKK蛋白能够被分成四个主要的组别，每一个都由高度显著的引导值所支持。7个卡诺拉油菜的MKKs分布在四个组，BnaMKK1，-2和-6属于A组，BnaMKK3属于B组，BnaMKK4和-5 属于C组，以

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