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胶原生物矿化的体外模型

摘要：

人体内有很多富含胶原的硬组织，例如：骨和牙本质，近年来，对于这些组织的矿化机理的研究有了很大的进展。尤其值得关注的是：碳酸化羟基磷灰石前体的瞬态矿物相位的识别，参与调控矿化的非胶原蛋白的识别和表征，以及我们对于胶原蛋白的结构的深入了解。这些进步不仅代表了人们对于胶原矿化方式的认识的改变，而且也带来了新的挑战。在这篇论文中，我们讨论了：关于非胶原蛋白在调控矿化过程中所起的作用这样的关键问题，体外模型是如何进行研究的；在矿化过程的早期，无定形磷酸钙和胶原蛋白相互作用的本质；以及在矿化过程中胶原蛋白的作用。为了加深对于胶原生物矿化的理解，我们着重分析了上述问题的重要性，同时，也指出了体外的实验系统固有的局限性。

1.导言

脊椎动物体内的硬性结缔组织有骨、牙本质和牙骨质，这些组织的形成包括了磷酸钙盐和胶原基质的沉淀，而胶原蛋白是组织的基本结构框架。对于与矿化相关的疾病的治疗方法的研究来说，理解矿物质在胶原中的沉积过程是必要的，同时，在生物仿生材料的设计中也有重要应用。胶原生物矿化的很多方面在观点上已经有了很大的转变，关键的问题在于理解剩下的部分。我们已经知道了矿化胶原的结构，但是关于在自然组织中，矿物质是如何在空间和层级上都有序地沉淀的问题还不是很清楚。因为在体内探究生物矿化是复杂的，体外的简化模型可以用于系统地检测胶原矿化的具体方面。在这里，我们回顾了在胶原生物矿化领域中现存的问题，以及运用体外模型寻求答案的研究进展。

1.1矿化胶原的结构

早期对于骨和牙齿的X射线衍射研究显示，矿化组织包含有机的胶原蛋白和无机的结晶磷灰石。不久后，Robinson和Watson发现碳酸化羟基磷灰石（简称磷灰石）的晶体存在于胶原蛋白中，因为它们的c轴和胶原原纤维的长轴几乎是平行的。结晶一般是2-6nm厚，30-50nm宽，60-100nm长。胶原蛋白的三维结构最早是由Hodge和Petruska通过著名的电镜实验提出的，这个结果促使四分之一交错模型的建立，在该模型中相邻胶原分子的位移是67nm。多年以来，这个模型不断地被完善，直到2006年，微纤维的晶体结构才被Orgel等人提出。许多研究显示，矿物偏向于在胶原纤维的空隙区域成核，大多数晶体能够有序地形成平行的结构，图中显示在连续呈黑色的区域。需要指出的是，虽然矿物质偏向于沉淀在胶原纤维的空隙区域，但是晶体是不断长大的，并且最终会超出空隙区域。而且，矿物质会同时存在于胶原纤维的内部和外部。但是，通常来说，大部分矿物是存在于纤维内的。

1.2矿物的相态

胶原的矿化最初被认为是传统的磷灰石晶体的沉淀和长大，这些晶体直接来源于间质流体，而间质流体则是几种磷酸钙盐的过饱和状态。在骨中矿物相态的本质在1960年左右被重新考虑，因为X射线衍射图像的缺陷和生物磷酸钙的化学组成的改变，这两个原因分别于1998年和2009年被Boskey和Rey等人提出。在磷灰石的结晶态之外还存在一种无定形的相态，它是一种瞬态的前体。这个结论是由Eanes等人做的溶液沉淀实验得出的，实验显示在近似的生理条件下，早期的沉淀物是无定形的，然后再转化为磷酸八钙（OCP），最后才是羟基磷灰石。总的来说，这些结果表明，体外实验中磷酸钙的沉淀作用是动力学驱使的，就是说，矿物质不会直接结晶成热力学上最稳定的状态。相反，它会先沉淀为动力学上最容易达到的形式，在这个实验中是无定形的磷酸钙，随后，再转化成热力学上最稳定的相态。最近，Habraken等人详细地研究了磷酸钙在体外沉淀和成核的具体机制。

然而，由于缺乏令人信服的包括无定形磷酸钙（ACP）在内的前体相态在体内存在的证据，普遍认为，即使ACP和OCP存在于体外实验的模型中，它们也不太可能存在于正常的体内矿化中。而且，无定形相态和生物矿物都是无序结构，这样的本质使得区分它们变得困难，这点在Johnsson和Nancollas的论文中有详细的分析。

然而，最近通过运用灵敏的技术和人工产物的样品准备，得到了越来越多的瞬态的前体相位在体内存在的证据。Crane等人通过拉曼光谱仪证实，在活的老鼠的颅骨组织内存在类磷酸八钙的中间相态。之后，瞬态的无定形磷酸钙被报道存在于老鼠的牙釉质中，成长中的斑马鱼的鳍骨中，以及老鼠的颅骨和长骨中。Mahamid等人进一步证实了，在成长区域中矿物质是以小球状（可假定为无定形磷酸钙）从细胞中被释放出来，这些小球散布在胶原纤维中，然后转化为磷灰石。这些结果与之前的核磁共振的研究保持一致，研究证实了质子化的磷酸基团的存在，它是骨中非磷灰石成分的一部分。总的来说，这些观察结果使得一些观念得到了极大的转变，是有关在结缔组织中矿物质的形成过程的观念。但是，有关矿物质的起源和它是如何渗入胶原纤维的问题还是未知的状态。一些体外模型试图去阐明相关的机制，在这篇论文中也将被探讨。

1.3非胶原蛋白

很明显，不是所有胶原组织都矿化，在一些实例（如：通过牙周韧带将牙根附着到颌骨上）中，矿化（骨和牙骨质）和非矿化（牙周韧带）的组织是紧密地排列在一起的。细胞外基质非胶原蛋白（NCPs）被认为对矿化过程的某些方面起调控作用，具体是通过磷蛋白和蛋白聚糖参与的抑制和促进的机制。Veis和Perry发现的牙本质磷蛋白（DPP）是磷蛋白参与矿化过程的第一个证据，DPP富含丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基。他们猜测在骨和牙本质中，当与胶原蛋白的超结构结合时，这种重度磷酸化的酸性蛋白质能够使羟基磷灰石成核。这个范例支持了羟基磷灰石的外延生长，同时将它与和胶原蛋白结合的NCPs联系在一起。

目前，有几种已知的非胶原蛋白被认为对矿物的沉积、定向和相位起调控作用。同样地，关于这些蛋白在矿化过程中所起的作用的体外研究也很广泛。一些最初的模型运用凝胶沉淀分析特定蛋白质的作用，例如：骨涎蛋白（BSP）。虽然这些系统对于蛋白质在羟基磷灰石沉淀过程中所起的作用提供了有价值的信息，但是它们无法解决矿物质、蛋白质和胶原之间相互作用的复杂性问题。在沉淀模型中，蛋白质的浓度以及蛋白质是自由的还是固定的都会深刻影响它的功能。

关于特定蛋白的作用，大多数的体内证明来自它们的分布和基因敲除研究。然而，许多参与矿化的蛋白质（例如：骨桥蛋白）有多重作用，这使得解释变得复杂。对于蛋白质的作用，组织的位置能够给予线索，但是无法提供准确的功能信息，特别是对一些有着不同功能的蛋白质。此外，生物冗余性限制了敲除模型的效果。一些敲除研究提供了矿物抑制作用或促进作用的清晰证明，像敲除基质Gla蛋白（MGP）的例子，其他存在微弱的表型，限制了其他可获得的信息。

体外的模型系统能够解决许多体内模型的问题。更具体一些，已经有运用体外模型模拟矿化的胶原纤维成功的例子。这些胶原矿化的模型使用了多种胶原基质，范围从重构的胶原到天然的组织。众所周知，单独的胶原是无法在体外矿化的，即使具备了在天然矿化的胶原中相同的胶原矿物关系。更成功的尝试也没有形成纤维间矿化。然而，最近Gower与他的同事使用各种各样的胶原基质，成功地重现了纤维间的矿化。他们的模型使用聚天冬氨酸模拟可溶性的非胶原蛋白（之后会涉及）。对于非胶原蛋白在胶原矿化中的预想作用，这个实验以及之后的其他实验有着深远的影响。

1.4研究范围

在过去的几年中，很大程度上基于Gower和他同事的工作，许多体外系统被研制出来，目的是解决关于胶原生物矿化机制的还未解决的问题。这篇论文的目的是讨论最近的这些体外实验研究是如何在分子层面给出关于胶原，矿物质和NCPs之间相互作用的细节。因为其他的论文已经解决了体外研究中关于骨的结构、性质和形成的问题，在这里我们专注于体外胶原矿化的无细胞模型，为了强调矿化过程中的机制细节。我们将论文分成了四个不同的部分，每一部分侧重于与具体问题有关的悬而未决的问题，如下所述：

（1）非胶原蛋白质的作用：这些蛋白质对于体内的骨生成和牙质生成都是必需的。它们是如何调节胶原矿化的?

（2）前体相态的作用：无定形磷酸钙是如何渗透进胶原的?是什么调控它转变为磷灰石的?

（3）在空隙区域矿化：在空隙区域矿物质空间受控的沉积是如何调控的?

（4）在矿化过程中胶原的作用：越来越多的证据显示胶原积极控制着矿化过程中磷灰石的形成。在这个过程中，胶原的作用是什么?它是如何与矿物质相互反应的?

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3.前体相态的作用

体内实验显示，在骨骼生长前沿，无定形的前体相态是由成骨细胞释放到胶原纤维中的。一个重要的问题出现了，那就是：ACP是如何渗入胶原的。在这里，我们提出两种不同的观点。一种可能性是：磷酸钙渗入胶原是通过溶解再沉淀的机制，一旦沉积在细胞外基质上ACP就会溶解，然后离子会渗透进入胶原。这个假设和一个想法是一致的，就是矿化是通过离子渗入胶原而后成核为磷灰石。但是，没有证据证明ACP的溶解和再沉淀于胶原内部。第二个假设是：ACP是自己进入胶原的。最初的理论是：ACP以类液体的形式存在，可以通过毛细作用力渗入胶原。最近的研究显示，ACP渗透进胶原的过程是由胶原中特定部位聚合物-矿物复合物与胶原纤维之间的电荷相互作用介导的。在这个过程中，有一些问题并不是很清楚，例如：聚天冬氨酸（pAsp）是否与矿物一起进入胶原纤维，渗透的过程是否仅仅取决于电荷相互作用或者毛细作用力，以及是否有其他的因素参与其中。但是，已知的是pAsp渗入胶原对于矿化的诱导不是必需的。

体外实验说明ACP聚合物的大小对于矿化是很重要的，聚合物越小，渗入胶原的速度和磷灰石的形成越快。这些结果与胶原的体积排阻特性保持一致，就是胶原会限制渗入纤维的分子的大小。大于40kDa的分子无法渗透进胶原，而小于6kDa的却很容易渗入纤维。有趣的是，用分子量大的pAsp反而使得矿化过程更快，而且纤维内的矿物含量更高。在这种情况下，合理的解释是胶原矿化的速度与ACP在溶液中的稳定性相关。相比于分子量小的聚合物，分子量大的聚合物对于磷灰石成核有更强的抑制效果，可以长时间稳定ACP，使之以小颗粒或者纳米微滴的形式存在。这些微滴小到可以渗入胶原中，使之矿物含量增多。

在去矿化的老鼠牙周组织切片的再矿化实验中，Lausch等人评估了由pAsp稳定的一系列亚稳态磷酸钙溶液形成的矿物的相态。实验表明，当矿物沉积速率总体较慢时，仅形成ACP，而随着矿物沉积速率的增加，形成了定向的磷灰石晶体。他们认为快速形成的ACP是不稳定的，因此会更加快速地转化为磷灰石。在铜离子存在的情况下进行的矿化实验证实了这一假说，铜离子具有稳定ACP并抑制其转变为磷灰石的作用。用模拟体液或在铜离子存在下形成的ACP可以长时间保持稳定。上述结果说明了，ACP颗粒必须长时间保持稳定才能渗入胶原中，但也不能太稳定，否则在胶原内部结晶成磷灰石的过程会被抑制。基于这些体外研究，可以假设在体内沉积于胶原纤维上的ACP应具有与体外实验中相似的特征-负电荷并且由松散聚集的磷酸钙复合聚合物组成，可以渗入进胶原。但是，这是否确实还需要验证。

4.矿化起始于空隙区域

指导胶原空隙区域成核的因素依然难以捉摸。已经使用几种体外方法来研究胶原蛋白中磷灰石形成的空间特异性的机制。关于胶原蛋白的氨基酸序列和结构的分析表明，被报道晶体成核的空隙区域中的特定位点同时含有带正电荷和负电荷的氨基酸簇。这些氨基酸的侧链可以形成一种使钙离子和磷酸根离子配位的三维环境，因此，可以为磷灰石提供成核位点。此外，钙离子和磷酸根离子优先结合到空隙区也被认为是该区域灵活性的结果。然而，大多数体外研究报道，磷灰石晶体在空隙区和重叠区中都会成核，这表明一定有另外一个机制来指导磷灰石在特定位点形成。另一个假设是相邻纤维的空隙区域产生通道，提供空间并允许矿物在其中形成。虽然空间限制确实发挥作用，但是在胶原的空隙区域和重叠区域都观察到体外磷灰石成核的事实表明，空间的可用性并不限制晶体生长。事实上，晶体在生长时能够推离胶原分子，因此在重叠区域中也可以形成矿物。

非胶原蛋白被认为也可以指导空隙区域磷灰石的形成。几个关于这些蛋白质和胶原蛋白相互作用的体外研究表明，牙本质磷蛋白（DPP），牙本质基质蛋白1（DMP1）和骨涎蛋白（BSP）都能够与胶原的空隙区域结合。尤其，DPP主要与胶原蛋白e带结合，磷灰石晶体被观察到在此成核。然而，在Deshpande等人进行的体外矿化实验中，DPP没有诱导磷灰石在空隙区优先形成。值得注意的是，在再矿化的胶原纤维中，观察到去矿化牙本质条带的再矿化。这与大多数重构胶原系统形成对照，并且对NCPs可以指导空隙区优先矿化的概念进行了支持，因为，在去矿化组织的模型里，脱矿过程中一些NCPs通过同时固定被保留下来。最近，通过使用聚丙烯酸（pAA）和无机多磷酸盐的混合物作为添加剂来诱导胶原纤维内矿化的方法，得到了磷灰石在胶原纤维离散带中的优先形成。作者的假设是：矿物质形成的区域对应于胶原的空隙区，因此可以模仿体内胶原蛋白的矿化。然而，矿化的区域是否对应于空隙区域尚不清楚。在这个系统中，pAA具有与pAsp类似的功能，可以促进纤维内矿化。但是，pAsp诱导的是均匀分布在整个纤维中的离散晶体的形成，而pAA诱导的是填充在纤维分子间的磷灰石长晶体的形成。pAA与多磷酸盐的组合可以促进胶原中周期性条带里较小的离散晶体的形成。作者认为，多磷酸盐复制了DPP，DMP1和BSP所谓的功能，能够指导空隙区域的矿化。他们假设：类似于DPP，DMP1和BSP，多磷酸盐结合到胶原蛋白的空隙区域，并且在此形成磷灰石成核的模板。然而到目前为止，在这方面没有直接的实验证据。

5.矿化过程中胶原的作用

胶原蛋白矿化的主要问题之一是胶原和矿物相互作用的本质。一方面，众所周知，单独的胶原不能诱导羟基磷灰石的形成，需

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