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Confinement controlled mineralization of calcium carbonate within collagen fibrilsdagger;

碳酸钙在胶原纤维中的限制性矿化

摘要

限制因素在生物系统中是常见的且在结构形成过程中扮演着重要的作用。然后，由于缺乏特定的化学结构和精密的空间分布的信息，我们对于生物矿化的限制影响知之甚少。在这篇文章中，我们探索了无定型碳酸钙在胶原纤维中的限制矿化，研究包括3个问题，包括在矿化过程中碳酸钙的形态学和特性的变化，还有在起始和矿化过程中的研究和将碳酸钙浸润到胶原溶液中后矿化的驱动机制，结果显示，带负电荷的碳酸钙由于静电吸引作用吸附到了胶原纤维的间隙区域，渗透到胶原纤维内然后转化为结晶相，对纤维表现无定型和结晶的的表面纤维显示二次成核的机制也许和方解石纳米晶体的成型方向有关，通过对镁离子改变无定型碳酸钙的湿润性证实了是毛细血管力驱动碳酸钙浸润到胶原纤维里，本研究不仅提供了限制影响在生物矿化中的证据而且也利于对于体内骨骼形成机制的理解。这项研究也许为人工生物合成先进材料提供了新的途径。

介绍

生物材料，例如骨头，牙齿，贝壳，拥有精致的层次结构和优异的机械性能。科学家对其独一无二的结构产生了极大的兴趣，并已经成功的设计并制造除了生物激活材料。此外，在生物系统中这种奇妙结构的形成是数十亿年的进化结果，在温和的自然环境中高效而准确的合成生物矿物。汲取自然合成生物矿物的经验，对我们发展人工先进生物材料有着帮助作用。

生物矿化是一个由时间和空间共同调节矿物机体功能和形成的过程。有机基质通常作为一个框架和模板使得无机底物在可溶性蛋白的环境中反应。例如，一个贝壳的形成是基于高度有序的基质联合蚕丝蛋白和酸性糖蛋白作用，该基质直接影响到了晶体的形态，生长方向和晶型。有人观察到无定型碳酸钙在脊椎的形成中对于特定结构的形成扮演了独一无二的作用。濑户的研究表明，海胆的脊椎的非平衡形态衍射为单晶体，具有玻璃断裂面，这项研究挑战了经典的单晶体行为。除了观察无定型相在生物矿化中的过程，值得注意的是不同级别的限制在生物矿化过程中也产生了重要的作用，例如人肾内草酸钙的生长，硅藻中二氧化硅的形成，还有胶原纤维中磷灰石的有序组织，生物矿化物质的功能和定位都是受到限制因素的极大影响，为了更好的了解生物矿物的形成过程，了解限制因素的作用就显得尤为重要。

科学家们研究限制生物矿化的机制并得到了可喜的观察结果，马斯做了一个实验室关于将钙磷酸盐置于纳米纤维胶原纤维中。纳米纤维和骨骼中的结构相似，这实验有可能为组织工程和新型复合材料提供了新的方向。马德里利用多孔膜作为模板从碳酸钙和磷酸钙中提取除了高度均衡的纳米线。这项研究的结果对人们对无定型相进入孔中，纳米线的比例，和产品的晶型的理解有极大的帮助。

比起用简单高效的人工系统来阐述生物限制，生物系统则更加复杂，因为生物系统有着特定的化学结构和精细的空间分布。在生物机体中寻找学习限制因素的影响可以引导我们发现自然中有趣的现象，而这些现象在也许在人工合成系统中还没有出现。一个合适的模型系统对于阐述受限生物矿化是十分重要的。

磷灰石的内部纤维矿化可以看做是一个受限生物矿化过程，被矿化的胶原是骨分区的基础，不论是从纳米尺度还是到宏观尺度。被矿化的纤维包括纳米尺寸的磷灰石晶体和纤维化的较原纤维，纳米晶体嵌入到有机基质中并且沿着纵向方向伸展，两者在多维度的相互作用赋予了骨的强度和韧性。

我们知道酸性非胶原蛋白在骨的形成中扮演着重要的作用， 非胶原蛋白里高含量的酸性氨基酸促进了无定型前体的形成和稳定，然后无定型前提渗透到胶原纤维中并转化为磷灰石晶体。胶原蛋白分子的精确的四分之一交错阵列结构赋予胶原原纤维40纳米长的间隙区带正电荷，促进带负电的无定形前体的渗透。受胶原原纤维在骨形成中的作用的启发，各种矿物质的原纤维矿化 已经实现了，包括二氧化硅，氧化钇稳定的氧化锆和二氧化硅 - 磷灰石多相。然而，这个过程我们仍然无法清楚的知道胶原纤维矿化和无定形前体渗透的驱动力这两个过程的原理。

在本研究中，我们探讨了胶原原纤维中ACC的局限控制矿化，主要有以下几个因素：（1）碳酸钙矿化是一种受欢迎的生物矿化模型体系，ACC的转化已被广泛研究; （2）可以明确识别碳酸钙的多晶型物; （3）ACC的化学成分可以通过不同的添加剂方便的改性，以促进结晶过程的处理。 研究了胶原原纤维中ACC的局限矿化三个问题，包括：（1）ACC在胶原纤维内的局限矿化的形态和特征（即碳酸钙的原纤维内胶原矿化）; （2）ACC在胶原原纤维内的局限矿化（即ACC的渗透和转化）的开始和发展; （3）ACC渗入胶原纤维的驱动机制。

结果与讨论

碳酸钙在胶原蛋白纤维的矿化

通过将重组的胶原纤维在含有100 mu;g / ml聚丙烯酸的矿化溶液中孵育72小时来实现碳酸钙的原纤维内胶原矿化（图1a）。 高放大倍数的SEM图像显示，纳米晶体尺寸为14.2plusmn;3.8nm沉积在胶原原纤维表面（图1b）。 原纤维直径从成矿后的201.6 plusmn;40.2 nm变化（图S1，ESIdagger;）到原纤维矿化后的793.0 plusmn;156.8 nm。 矿化期间胶原原纤维的膨胀可能是由纳米晶体渗透到胶原原纤维中引起的。 胶原蛋白的足够柔韧的液晶性质允许人造胶原分子被推开，然后将孔暴露在胶原表面上。在断裂的原纤维断面图中，原纤维内部明显地观察到纳米晶体的存在（图S2，ESIdagger;）。 72 h时形成的矿物结晶相以方解石（JCPDS No.05-0586）为指标，XRD图谱如图1所示（1c）。FTIR光谱显示在1420cm -1（C-0反对称伸缩振动）和874cm -1（碳酸根面外变形振动峰）处的两个特征带对应于碳酸钙的n3和n2模式。 分别在1550厘米-1和713厘米-1处的另外两个峰分别归因于胶原和结晶方解石的酰胺I的特征（图1d）

矿化原纤维的尖端由密集填充的纳米晶体组成（图2a）。 放大的TEM图像（图2b）显示纳米晶体的尺寸与SEM数据一致。 相关的SAED图谱显示方解石菱方结构的特征衍射点（图2c插图）。 晶面间距为0.30nm的晶格对应于方解石的（104）面（图2c）。 虽然矿化原纤维含有纳米粒子单元，但它并没有呈现多晶方解石的典型环状图案。 这表明纳米颗粒结构单元是高度取向和对准的。 略微的弧形衍射斑点表明纳米颗粒的边界之间存在小的晶格畸变.33纳米颗粒的HRTEM图像显示了一些扰乱晶格平面连续性（白色箭头）的镶嵌域。 这些镶嵌结构域在纳米粒子单元中可以是多孔的。图中连续的格子条纹（2c）也展示了纳米颗粒的高取向。

我们进一步研究了纳米晶体渗透到胶原纤维中的时间过程。 在矿化24小时内观察到矿物质的沉积作为不同大小的球形液滴（图S3a，ESIdagger;）。 微小的水滴倾向于聚集并结合成大颗粒。 胶原原纤维的表面被水滴（图3a）覆盖，胶体原纤维也会润湿。 由于大量无定形相涂覆在原纤维表面上的作用，24h内没有观察到结晶相的明显峰（图S4 ESIdagger;）。 在矿化48小时后，胶原纤维周围仍然存在球形液滴（图S3b，ESIdagger;。然而，观察到液滴逐渐渗入原纤维，以及纳米晶体在原纤维表面和内部的出现（图3b）。 在48小时内可见29度的弱峰和宽峰（图S4，ESIdagger;）。

在本研究中，球形液滴的形成是通过聚合物诱导的液体前体（PILP）过程，并且大量的液滴聚集在一起（图S5a，ESIdagger;）。紧密接触的液滴可形成较大的液滴（图S5b，ESIdagger;）。液滴的光滑表面和这些液滴之间的连接颈部表现出这些液滴的聚结。 TEM图像显示小液滴聚集在大液滴附近（图S5c ESIdagger;），表明这些液滴的液体状态。这些液滴的非晶性质通过选择的面积电子衍射显示（图3）。 S5d，ESIdagger;）。能量色散光谱（图S5e，ESIdagger;）表明，这些液滴的化学元素是钙，氧和碳。基于这些结果，将这些球形液滴推定为无定形碳酸钙。方解石在矿化24 h未形成，因为在713 cm -1处没有观察到FTIR光谱的特征峰（图3c）。然而，1080厘米-1处出现峰值，这意味着存在非晶相。在矿化48小时内，在FTIR光谱中观察到713 cm_1和1080 cm_1处的两个峰，表明方解石和非晶相存在于胶原纤维中（图3d）。该结果表明，从非晶相发生相转变为方解石。

同时实验证明了聚丙烯酸在胶原蛋白中碳酸钙的局限矿化中的重要性。如果矿化体系中不包括聚丙烯酸，则会导致具有菱形形貌的块状晶体的沉积（图S6a，ESIdagger;）。 XRD图谱显示菱方结晶相为方解石。（104）平面的强峰表示方解石晶体的取向（图S7，ESIdagger;）。较大放大倍数图像显示方解石台阶表面晶体由纳米颗粒的聚集组成（图S6b，ESIdagger;）。 这种表面纹理暗示方解石晶体的连续生长通过初级颗粒吸积发生。同时，胶原纤维缠结在方解石表面。胶原蛋白的特征带图案是不同的，并且原纤维变薄。

在含有天冬氨酸而不是聚丙烯酸的矿化体系中，截留的方解石晶体沉积在盖玻片上（图S8和S9，ESIdagger;）。没有观察到原纤维内矿化。这是由于单体不能引导聚合物诱导的液体前体过程。当在矿化系统中用另一种带负电荷的聚合物（例如卵白蛋白或聚苯乙烯磺酸盐）代替聚丙烯酸时，所得碳酸钙的形态和多晶型物与聚丙烯酸的形态和多晶型不同且依旧没有实现了碳酸钙的原纤维矿化（图S10和S11，ESIdagger;）。添加剂的性质，包括分子量，浓度和电荷分布可能影响矿化。与其他带负电荷的聚合物相比，聚（丙烯酸）的官能团是羧基，并且与Ca2 相互作用更有效。以上结果表明，聚丙烯酸对胶原纤维内碳酸钙生长至关重要。

还研究了浓度较低的无机离子（即5mM或2mM Ca2 和CO3_2）。在矿化体系中不含聚丙烯酸时，在盖玻片的表面观察到菱方解石晶体的沉积（图S12和S13，ESIdagger;）。 弯曲和皱缩的原纤维表明不发生碳酸钙的原纤维矿化。当在矿化体系中包含聚丙烯酸时，矿物晶体消失，胶原纤维附着在盖玻片上（图S14，ESIdagger;）。 胶原原纤维的带状图案表示胶原纤维内没有晶体。这是因为聚丙烯酸吸收钙离子，降低了低于液 - 液相分离临界点的钙浓度，并且阻止了局限的矿化过程。

ACC的渗透和转化

本研究调查了胶原纤维内ACC的局限矿化的起始和发展。在胶原矿化期间，在原始纤维的表面和内部观察到结晶相和非晶相的共存（图3b），在成矿48小时后，在原纤维的不同部分中鉴定了不同的结构和形态，其中是胶原原纤维周围的球形分布（图4a中的上方框）。 SAED图案显示ACC的漫射特征带（图4b）。在同一原纤维的另一部分（图4a中的下框）中，存在纳米颗粒而不是液滴。 SAED模式将相位证实为球霰石（图4c）。环型衍射图形公开了球霰石的多晶结构，其提供ACC相变成球霰石的直接证据。虽然用SAED鉴定了球霰石相，但是由于材料的不稳定性或材料量不足，因此无法用FTIR检测。

以上观察结果证实ACC对胶原原纤维的渗透过程以及ACC在胶原原纤维内的相变。在渗透开始时，球形液滴附着在纤维上并变成薄膜状。 ACC的流体特性有助于球形液滴的形状变化，并促进渗透到胶原纤维中。同时，无定形至晶体转变是能量下降的.38晶体相以瞬态球形ACC为代价。 ACC颗粒在结晶过程中由于水的排出而逐渐收缩。 ACC和结晶相之间的相界面明显地被观察到（图3b）。这意味着ACC进入结晶相的转化通过二次成核机理发生。 72小时后，ACC转化为结晶相几乎完成。中间不稳定的球霰石相通过溶解 - 再沉淀过程转化为最稳定的方解石.在二次成核过程中，现有的纳米颗粒可以模拟相邻成形晶体的取向。同时，胶原基质在应力松弛中起重要作用，这提供了纳米颗粒在宏观尺度上共同取向的位点。这也解释了中间层（图4c）中环型衍射图案到最终的弧形衍射斑点的变化（图2c插图）。

ACC浸润胶原原纤维的驱动力

已经实现了碳酸钙的胶原纤维矿化。 我们进一步研究了ACC渗透到胶原纤维中的驱动力的性质。 毛细管力或静电相互作用可能有助于ACC浸润。 以前的研究表明，Mg2 强烈影响ACC的润湿行为，直接控制有机 - 无机杂交体的矿化位置。为了研究ACC渗透原纤维的驱动力，Mg2 和Mg2 / Ca2 以1：1的比例掺入矿化过程中， 发现原纤维周围具有不规则形态的矿物质不会渗入原纤维（图5）。

通过动态光散射（DLS）数据分析ACC和Mg-ACC（具有Mg2 的ACC）在3小时矿化中的尺寸分布。 显示了ACC（图6a）的双峰分布，对应于初级粒子的50nm处的主峰和200至1000nm的另一峰，这意味着初级粒子的聚集，这与TEM数据一致（图6a）。 S5c，ESIdagger;）。 然而，显示出Mg-ACC（图6c）的窄尺寸分布，其表观平均直径为40nm，小于ACC。 M-ACC的分布在几乎没有聚结的溶液中是均匀的（图S15，ESIdagger;）。 EDS分析证明镁元素在无定形相中的存在以及Mg2 掺入到ACC中（图S16，ESIdagger;）。 由于ACC中Mg-O的键长短于Ca-O距离，Mg离子稳定了ACC的无序结构，防止了非晶相的聚集和结晶。

ACC和Mg-ACC的zeta;电位分别为pH7.4时为_18.9mV和-10.8mV（图6b和d）。带负电荷的ACC通过静电相互作用吸引到胶原纤维的带正电的间隙区域。已经证明，带负电荷的聚合物 - 非晶态复合物以及胶原原纤维中的带正电荷的结构域对于磷灰石形成的矿物质渗透是必不可少的。在本研究中，没有观察到带负电荷的Mg-ACC可以被吸引到原纤维中，表明非晶相和胶原纤维之间的静电相互作用不是碳酸钙胶原纤维矿化过程中唯一的主要因素。非晶相仅从间隙区域扩散到胶原原纤维中，较小尺寸的Mg-ACC可能更易于渗透。然而，本研究观察到大尺寸ACC而不是小尺寸的Mg-ACC可以渗透到胶原原纤维中。这导致毛细管力控制非晶相的渗透过程。发现ACC的结晶可以通过添加镁离子来禁止，这也可能改变渗入胶原纤维的驱动力。胶原原纤维

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