药用植物吊瓜有效的愈伤组织诱导和不定根的形成

Fenglan Zhao amp; Rong Wang amp; Jianping Xue amp; Yongbo Duan

摘要：吊瓜是一种具有较大药用价值的攀缘草本植物。在这研究中，建立了该植物愈伤组织介导的再生和离体块茎形成的有效方法，建立了该植物愈伤组织介导的再生和离体块茎形成的有效方法。无菌的茎和叶培养在加有植物生长调节剂的MS培养基上，来促进愈伤组织的诱导和再生。茎和叶组织在4.5-mu;M 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的MS培养基上诱导愈伤组织的效果最好（100%）。通过将愈伤组织暴露于4.6-mu;M激动素（一种细胞分裂素）、2.2-mu;M 6-苄基氨基嘌呤（一种人工合成的细胞分裂素）、2.7-mu;M 1-萘乙酸（NAA）和12.6-mu;M硫酸铜，再生率为85.5%，每个愈伤组织有28个芽。试管苗以半强度（1/2）MS培养基和2.7mu;M NAA生根效果最好。在短光照（8h）条件下，在5%（w/v）蔗糖生根培养基上诱导块根生根。生根苗在盆栽中成功地驯化，驯化率达90%以上存活率。本研究为愈伤组织介导的再生和离体块根的形成提供了一种有效的方法。

关键词：吊瓜，愈伤组织，芽形成，硫酸铜，不定根形成

栝楼属是葫芦科植物，由50多种植物组成广泛分布在澳大利亚，中国，日本，朝鲜和东南亚。在这些物种中吊瓜是一种多年生植物具有重要的药用食用价值。它通常会生长达6米，匍匐生长(Wang et al. 2009)。使其成为重要的绿化观赏植物。经过加工它的种子成为流行的保健零食。更重要的是，它包含多种生物活性成分被证实能有效治疗心脏病和肺病（Shu等人。2009年），咳嗽，炎症，糖尿病（Dat等人。2010），和肿瘤（Lee等。2013年）。在吊瓜块根中27-kDa核糖体失活蛋白，称为滴虫肽，具有广泛的药效，包括抗肿瘤（Cui等。2015）和抗免疫缺陷特性（Yang等。2014年）。因此吊瓜是50种基本重要之一，是十分有价值的中药。（Fan等人，2013）。.然而，环境条件的恶化和过度开发对野生吊瓜种群造成巨大威胁。因此迫切的需要商品化种植。

吊瓜种子发芽不良是吊瓜大规模种植的一个障碍。（Xu 和 Zhang，2008）。一般来说，采用劈根法扩大栽培面积，但营养增殖系数低，而且种质退化也阻碍了这些方法的发展。因此，确定合适的组织培养技术将是促进我国大规模生产吊瓜的有效途径。因此组织离体培养是大规模培养吊瓜的唯一出路。

吊瓜植株从中国安徽天柱山(30° 44′ 12.99Prime; N, 116° 27′ 18.84Prime; E),采集放在土里带回。这些植物作为外植体组织的来源（树叶）用于本研究。

MS培养基以最大强度诱导愈伤组织芽再生，半强度生根以及块根化。培养基中含3%（w/v）蔗糖和0.3%（w/v）琼脂 并在用植物生长调节剂和有机物进行高压灭菌以及无机补充剂。每个培养基的pH用100-mM的氢氧化钾调到5.8。培养基在103千帕和121摄氏度下高压灭菌20分钟。除非另有说明，否则培养物保持在25plusmn;1°C，在冷白色荧光灯提供的16小时光周期下轻35mu;mol光子辐射m-2 s-1，相对湿度60%。使用的MS培养基、蔗糖和PGRs从Sigma-Aldrichreg;获得。

表 1

将茎段浸在氯水中25分钟。消毒过的外植体用消毒水冲洗5次，在消毒过的滤纸上表面干燥，插入含有1.3-uM6-苄基氨基嘌呤(BAP),0.3-mu;M吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基上。外植体直立插入，与原植体方向一致。

无菌苗长到5cm后，茎片段和叶子被切成大约长1.0厘米，截面1.0平方厘米，分别放置含4.5-mu;M 二氯苯氧乙酸（2,4-D）的MS培养基诱导愈伤组织。那么外植体经培养皿培养，背面为叶子向下，茎平放在茎上。培养物在25plusmn;1°C的黑暗中孵育4周。

为了优化离体器官的的培养，将愈伤组织转移到含有0.0,2.2,8.8-mu;M BAP和0.0,2.3,4.6mu;MKT以及1.1,2.7mu;M NAA 的MS培养基。四周后计算出产生芽的愈伤组织百分比和每个愈伤组织的芽数。此外，还研究了0.0、12.6或31.5mu;M硫酸铜对愈伤组织分化的影响。当嫩枝长到3厘米长，然后转移到360ml塑料瓶（78mmtimes;78mmtimes;95mm），含60毫升半强度MS培养基，含2.7-mu;M NAA生根。将生根苗移入5L塑料盆中含蒸压商业营养土（80%砂质壤土、10%蛭石和10%珍珠岩）和温室温度为25plusmn;1°C。

再生芽移入含半强度MS培养基的250ml烧瓶中，用2.7mu;M NAA生根，不同3%，4%，5%，6%或7%（w/v）蔗糖诱导根发育。培养物在冷白色提供的8小时光周期中培养荧光灯辐照度为35-mu;mol pho tons m-2s-1。测量直根用直尺，根径用5周后在底座上使用游标卡尺。

每种处理，使用60个外植体（n=60）。全部实验分别重复三次。这个数据用IBMreg;SPSS进行统计分析。变异分析（方差分析）用于确定统计显著性，以及平均值plusmn;标准误差之间的显著差异（SEM）值使用邓肯倍数范围计算plt;0.05的试验。

培养7天后，茎段两端开始扩张，两周后愈伤组织开始形成。对于叶片外植体，愈伤组织也在2周后从边缘再生。茎和叶愈伤组织诱导率达100%。

检测细胞分裂素（BAP和KT）和NAA它们之间的相互作用对愈伤组织有显著影响差异（表1）。愈伤组织在移栽再生2周后开始膨大并形成芽原介质（图1A）。再2周内形成芽（图1B）。MS培养基，4.6-mu;M KT，2.2-mu;M BAP，和8.8-mu;M NAA的效果明显优于所有其他试验培养基中，59.4%的愈伤组织块形成芽。值得注意的是，当8.8mu;M BAP单独添加到再生培养基中时，无论是1.8mu;M NAA还是2.7mu;M NAA处理都没有再生芽，并且当8.8mu;M BAP与2.3或4.6mu;M KT组合时，产生的芽数非常低。在8.8mu;M BAP作用下，大部分愈伤组织在1周后开始扩张。但是，愈伤组织变成褐色，最终死亡。结果表明，8.8mu;M的BAP具有抑制作用，并具有协同作用2.2mu;M-BAP和4.6mu;M-KT对芽再生的影响。相反的结果记录在香蕉培养物中，其中BAP比KT更适合芽诱导（Muhammad等人。2007年）。这种差异很可能是由植物种类的差异引起的。

图 1

在生根培养基上生根，2周内可形成健壮的根系。适应土壤的根茎生根率gt;90%（图1C，F），表明吊瓜在体外容易生根。

为了研究硫酸铜对麒麟菜愈伤组织分化的影响，在再生培养基中加入硫酸铜并优化PGRs。在再生培养基中加入12.6mu;M硫酸铜，愈伤组织分化率提高到85.5%，显著高于不加硫酸铜的愈伤组织（plt;0.05），而各愈伤组织的总芽数无显著降低（pgt;0.05）。在再生培养基中加入31.5mu;M硫酸铜，愈伤组织分化率和总芽数均下降（表2）。这表明，12.6mu;M硫酸铜能有效地促进吊瓜愈伤组织的分化，其他植物如高粱（L.）Moench（Wu等）也有类似的现象。2014年a），蛇根草（Ahmad等人。以及Zea mays L.（Cho等人。2015年）。

表 2

每个培养的愈伤组织很容易产生近30个植株（表2），这比直接从麒麟菜的叶子或茎上再生显著地高。这些结果表明，所提出的方法为吊瓜的离体繁殖提供了一种更有效的途径。

当在生根培养基中加入3-7%（w/v）的蔗糖时，长度和直径都会受到影响（图1D，E）。根长随着蔗糖浓度的增加而减小，说明高浓度蔗糖促进根的伸长而不是生长。蔗糖浓度为3%时根系最长（plt;0.05）。同样，在培养基上，根直径增加到0.89厘米含5%（w/v）蔗糖，而含3%（w/v）蔗糖的培养基为0.11cm（plt;0.05）。蔗糖浓度持续增加时，根的直径没有增加（表3）。结果表明，在生根培养基中添加5%（w/v）蔗糖，可促进吊瓜块茎的形成。在木薯的的块根诱导实验中也发现了蔗糖的类似作用。（Wu等人。2014）这可能是由于蔗糖浓度的增加提供了更多的能量和碳骨架，同时改变了渗透压，有利于根系的扩张。

表 3

本研究确定了一个有效的愈伤组织诱导再生和离体块根形成的方法。叶片和茎段外植体在MS培养基上均能产生高质量的愈伤组织，其中以MS-me-dium 4.6mu;M KT、2.2mu;M BAP、2.7mu;M NAA和12.6mu;M硫酸铜培养基的愈伤组织再生率最高，分别为85.5%和28个芽。试管苗在半强度（1/2）MS培养基上生根，NAA为2.7mu;M。在含5%（w/v）蔗糖的生根培养基上能有效地诱导块根。生根苗在盆栽中成功地驯化，成活率达90%以上。这是一种有效的愈伤组织诱导再生和离体块根形成的方法。

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