MTase15调控翅二型飞虱的繁殖(半翅目:飞虱科)

原文作者Xu Nan;Chen Hao-Hao;Xue Wen-Hua;Yuan Xiao Bo;XiaPei-Zhi;XuHai-Jun;

单位State Key Laboratory of Rice Biology,Zhejiang University, Hangzhou,310058,China;Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogens and Insect Pests, Zhejiang,University,Hangzhou,310058,China;Institute.of

Insect Sciences,Zhejiang University,Hangzhou,310058,China.

摘要：腺苷酸-l-蛋氨酸依赖的甲基转铁酶(SAMMTases)调节原核生物和真核生物重要的细胞和代谢活动。在这里，我们对迁移的褐飞虱(BPH)，即亚洲最臭名昭著的水稻害虫褐飞虱的SAMMTase基因(MTase15)进行了功能鉴定。MTase15的cDNA序列长度为2764nt，开放阅读框为1218nt，编码405个氨基酸残基。实时荧光定量PCR分析显示，MTase15在卵至成虫期均可检测到，广泛分布于成年雌虫和雄虫的各个身体部位，卵巢和睾丸的MTase15含量略高。此外，MTase15在BPH中被胰岛素信号通路转录调控。RNA干扰介导的MTase15 (dsMtase15)表达水平下降导致卵黄蛋白合成和卵子生成不足，并导致雌性不育。Mtase15基因敲除的雄性保留了产生正常生存能力的精子的能力，但在交配过程中很少有精子被转移到野生型(wt)雌性体内，这些野生型雌性产下的卵阻止了胚胎发生。这些发现不仅为MTase15赋予了功能作用，还为BPH繁殖中的胰岛素信号通路和表观遗传调控提供了联系。

关键词:飞虱、甲基转移酶、胰岛素信号通路、生殖、精子

介绍

迁徙的褐色飞虱(BPH)，褐飞虱(半翅目:Delphacidae)，是亚洲最臭名昭著的水稻害虫^[1]。它只以水稻为食，会导致水稻完全枯萎^[2,3]，并且导致水稻产量的巨大损失。翅型二型性—即能够发育成长翅(LW)或短翅(SW)成虫的能力，同时高繁殖力对褐飞虱在自然和农业栖息地的生态做出了显著贡献^[4]。最近，我们发现LW和SW褐飞虱的发育受胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路(IIS)调控^[5,6]。两个胰岛素样受体(InR1和InR2)通过调节叉头转录因子(FoxO)的活性，在控制LW和SW的发育中起相反的作用。InR1通过活化磷酸化肌醇肽3-激酶-akt/蛋白激酶B (PI3K-Akt)信号通路来激活FoxO，导致LW的形成。相反，InR2负调控InR1-PI3K-Akt信号通路，导致SW突变。

IIS通路是一条进化保守的营养传感通路，调节生理的各个方面，如新陈代谢、生长周期和生长发育，并在后生动物的雌性生殖中发挥关键作用^[7,8,9,10]。黑腹果蝇的遗传证据表明，InR突变会使雌性产生短翅，且在雌性生殖前期造成卵子发育受阻^[11]。基因切除胰岛素共受体Chico可阻断卵腔进入卵黄形成^[12,13]，这个过程包括FoxO和其他信号通路^[14]。这一研究表明，除了翅型的确定外，IIS通路也可能参与了褐飞虱的繁殖。

S-腺苷-1-蛋氨酸依赖性甲基转移酶(SAMMTases)是一类广泛存在于原核生物和真核生物的酶,利用S-腺苷蛋氨酸(SAM)催化将甲基添加到DNA, RNA,蛋白质,脂类和较小的代谢物,从而调节重要的细胞和代谢活动^[15,16]。在本研究中，我们发现SAMMTase基因的MTase15被IIS正向调控。组织趋向性分析显示，除了脂肪体外，MTase15在成年雌性和成年雄性的各种组织中普遍表达。RNA干扰(RNA interference, RNAi)介导的功能检测显示MTase15 (dsMTase15)基因敲除可导致雌性不育，其机制可能与卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)合成及卵子生成缺陷有关。此外，尽管经dsmtase15处理的雄性保留了正常的精子产生能力，但在与雌性交配后，雄性的精囊中精子变少。野生型(wt)雌性与经dsmtase15处理的雄性交配后，雌性卵子发育受阻。这些发现不仅揭示了MTase15功能作用，也为飞虱繁殖的IIS途径和表观遗传调控提供了联系。

结果

MTase15的序列和时空分析

MTase15的全长cDNA序列是利用从全身提取的总RNA样本，通过5和3快速扩增cDNA末端(RACE)程序得到的。MTase15 cDNA的长度为2764 nt，包括一个803 nt 5未端翻译区(UTR)、一个1218 nt的开放阅读框(ORF)和一个743 nt 3-UTR(图S1)。MTase15 ORF包含405个氨基酸残基，与来自白蚁的同源基因有着高度序列一致性(62%)。采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测MTase15的时空表达情况，MTase15在卵至成虫阶段均有表达(图1A)。组织检查显示MTase15在成年雌性中广泛表达(图1B)，在成年雄性睾丸中相对较高，其次是头部和腿部;脂肪中含量最少(图1C)。

图1所示。褐飞虱MTase15的时空表达。qRT-PCR定量分析了MTase15从卵细胞到成虫的转录本(A)，以及成体雌性(B)和成体雄性(C)的组织分布。

MTase15受IIS通路正向调控

使用qRT-PCR对BPHs中的MTase15转录样本进行定量，这些褐飞虱之前已针对IIS通路的四种成分:FoxO、InR2、InR1和Akt进行dsRNA处理。与靶向编码绿色荧光蛋白(dsGfp)基因的dsRNA相比，FoxO (dsFoxO)或InR2 (dsInR2)基因的敲除轻微但显著地增加了MTase15的表达(图2A)。相反，InR1 (dsInR1)或Akt (dsAkt)的下调显著降低了MTase15的表达(图2B)。这说明MTase15是BPHs中IIS通路的下游靶点，其表达依赖于foxo。

MTase15基因的下调导致女性不育

为了研究MTase15在雌性生殖中的作用，我们进行了配对实验。用dsRNA靶向MTase15 (dsMTase15)处理四龄若虫，3天后用qRT-PCR检测RNAi效率。结果显示，dsMTase15处理显著降低了其表达(图3A)。剩下的若虫培养至成虫，待成虫后，将其中雌虫收集起来与wt雄虫交配。交配后，雌性进行产卵10天。结果表明，经dsmtase15处理的雌虫未产卵，但经dsgfp处理的雌虫每只雌虫产卵约200枚(图3B)。为了验证这一观察结果，我们在白背飞虱中敲除了一个MTase15同源基因(SfMTase15)。白背飞虱中的S-fMTase15基因的下调也导致了雌性不育(图S2)，这与褐飞虱中观察到的表型相似。这些观察提示MTase15可能在飞虱家族的生殖调节中发挥保守作用。

MTase15基因的突变阻止了卵子的生成

考虑到MTase15的干扰导致女性不育，我们检测了RNAi治疗后卵巢的发育。dsGFP处理时，卵巢从第1天羽化不成熟(第1天)逐渐发展到第3天和第7天成熟(图4)。相反，dsMTase15处理后，在第3天和第7天导致成虫卵巢发育不全，这在形态学上与第1天相似(图4)，表明发育提前终止。为了证实这一发现，我们通过敲除蛋氨酸代谢途径中SAMMTase上游基因SAM合成酶（Sam-S）来检查了雌性卵巢发育 ^[17]。SAM-S的作用是将蛋氨酸转化为SAM，随后成为SAMMTase用作甲基化的供体。我们发现，敲除Sam-S基因的雌虫能够抑制dsMTase15治疗，在蜕皮后第3天观察到雌虫卵巢发育不成熟(图S3)。

为了更好地了解dsMTase15治疗雌性卵巢缺陷的分子基础，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了Vg的表达。qRT-PCR结果显示，经dsMTase15处理的雌性Vg表达显著低于经dsGFP处理的雌性(图5A)。Western blot分析显示，在dsMTase15处理的卵巢中几乎没有检测到Vg，而在dsGfp处理的卵巢中检测到两个约为40和65 kDa的稳定条带(图5B)。此外，与dsGFP处理相比，经dsNlMTase15处理后，在脂肪体中检测到的Vg更少(图5B)。这一证据表明，MTase15基因敲除可能影响脂肪体中Vg的表达，这在一定程度上导致了卵子生成缺陷。

MTase15基因的下调导致雄性不育

为了检测MTase15基因的下调是否会影响到小鼠的生育能力，dsMTase15基因处理的雄性小鼠与wt雌性小鼠配对进行配对试验。收集10天内雌虫产下的卵进行分析。wt雌性与dsMTase15处理过的雄性交配产卵，明显少于与dsGFP处理过的雄性交配产卵数量(图6A)。

图2.通过胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路调节MTase15。用靶向FoxO（A），InR2（A），InR1（B）或Akt（B）的双链RNA处理四龄若虫。用dsGFP处理的若虫用作平行对照。收集0-12h羽化的成年雌虫，采用qRT-PCR检测。MTase15的相对表达通过rps15标准化。从三个独立重复中得出的条形图（平均值加/减标准偏差）。两组间的组织比较采用双侧t检验(**Plt;0.01)

图3.MTase15基因敲除的雌性的繁殖力。（A）检查RNA干扰效率。MTase15的相对表达通过rps15标准化。（B）MTase15敲低后的雌性生殖力。将新出现的成年雌性与野生型(wt)雄性配对，并进行交配产卵10天。 每个圆圈代表单个雌性产生的卵。条形表示平均值的正负标准偏差。两组之间的统计比较使用了双侧t检验（**Plt;0.01）。

接下来，我们通过检查眼睛色素沉着来检查胚胎发生，这是褐飞虱胚胎发育的一个特征标志。wt雌蚊与经dsGFP处理的雄蚊交配产下的卵，在产卵后5天内通常出现眼部色素沉着(图6B)。相反，wt雌蚊与经dsMTase15处理的雄蚊交配后产下的卵中没有出现眼色素沉着(图6B)，这表明胚胎已经停止发育。

图4.MTase15敲低后的卵巢形态。用dsMTase15或dsGFP处理四龄女性若虫。在成虫羽化后的第一天，第三天和第七天解剖卵巢。卵巢（O），输卵管（LO）和精囊（S）用箭头指向。[彩图使用wileyonlinelibrary.com查看]。

图5.敲除MTase15后褐飞虱卵黄蛋白原(Vg)的表达。用dsMTase15或dsGFP处理四龄雌性若虫。将处理后的成虫培养0-12h后，进行qRT-PCR(A)和Western blotting分析(B)。 每个圆圈代表来自单个雌性的Vg转录物，并且Vg的相对表达通过rps15标准化。为了进行蛋白质印迹分析，将卵巢和脂肪体解剖，然后用抗Vg单克隆抗体进行免疫印迹。使用抗beta;肌动蛋白的抗体进行平行对照。右侧显示了基于每种情况的三份重复的脂肪体内Vg表达的光密度分析。

为了深入了解胚胎发生缺陷的原因，我们首先检测了接受dsMTase15处理的雄性精子活力。结果显示，经dsMTase15处理的雄鼠与经dsGFP处理的雄鼠的活精子具有可比性(图7)。由于雌鼠的精囊具有从雄鼠接收和储存精子的功能，因此，我们对雄鼠的精囊进行了解剖，以研究在交配过程中精子是否从雄鼠转移到雌鼠。在与dsMTase15或dsGFP处理的雄鼠交配的wt雌鼠体内成功检测到精子，但前者的精子数量明显少于后者(图8)。这些研究表明，MTase15基因敲除可能影响精囊中的精子存活能力，或在交配过程中影响精子从雄鼠向雌鼠的转移能力。

讨论

FoxO是IIS活性的主要转录因子，在后生动物中起多种作用，包括应激抵抗、代谢、细胞周期阻滞和凋亡^[18,19]。FoxO转录靶点的识别揭示了第二层转录因子，它调节多种其他下游反应^[19]。在埃及伊蚊中，FoxO基因的敲除导致产卵明显减少^[20]。在果蝇中，FoxO阻止了IIS诱导的卵子发生^[14]。这些研究表明，FoxO与多种昆虫的繁殖密切相关。为了全面分析与褐飞虱繁殖相关的FoxO靶点，我们对经dsInR2处理、dsFOXO处理和dsGFP处理的变种进行了RNA测序(RNA-seq)分析。RNA-seq数据存储于GenBank，登录号为PRJNA530174。值得注意的是，一个功能不明确的SAMMTase基因MTase15在dsInR2或dsFoxO处理后上调。qRT-PCR分析证实MTase15受IIS通路正向调控(图2)。RNAi介导的功能检测显示，MTase15与雌性和雄性生育能力密切相关。

图6.敲除MTase15影响男性的生育能力。用dsMTase15或dsGFP处理四龄雄性若虫。将新出现的雄性成虫与野生型(wt)雌性配对，然后产卵10天。(A)

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