OsHLH61-OsbHLH96通过调节病原相关基因影响水稻对褐飞虱的防御

Meiling Wang^1,2, Dongyong Yang^1,2, Feilong Ma^1,2, Mulan Zhu³, Zhenying Shi¹ and Xuexia Miao^1*

摘要：

背景：在植物中，基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白形成最大的转录因子（TF）家族。其中，HLH蛋白是一小部分不典型的成员，缺乏基本结构域，并与bHLH蛋白形成二聚体。尽管已经证明bHLH蛋白在植物发育和生理中起重要作用，但是很少研究HLH蛋白的功能，更不用说在植物生物抗性中了。褐飞虱（BPH）是一种水稻特有的昆虫，每年导致毁灭性的生产损失。

结果：在这项研究中，我们确定了编码HLH蛋白的OsHLH61基因。OsHLH61基因在受到BPH侵扰后可能被高度诱导。此外，甲基茉莉酸（Me-JA）和顺式12-氧代植物二烯酸（OPDA）诱导了OsHLH61的表达，而SA抑制了它的表达。我们通过RNA干扰（RNAi）敲除了OsHLH61的表达，转基因植物易受BPH侵染。RNA-seq分析显示某些在水杨酸（SA）信号传导途径中介导植物免疫力的病原相关（PR）基因的表达在OsHLH61 RNAi植物中明显下调。同时，酵母双杂交测定和双分子荧光素酶互补（BiLC）分析鉴定bHLH096是OsHLH61的相互作用因子。此外，OsbHLH96中的一些PR基因被降低过分表达。OsbHLH96的表达受到抑制。此外，OsbHLH96可能与Jasmonate Zim-Domain3（OsJAZ3）进行交互。

结论：我们总共鉴定出一种OsHLH61–OsbHLH96复合物，该复合物可能通过调节PR基因介导BPH的防御。OsHLH61–OsbHLH96在介导SA和JA信号串扰中可能很重要。

关键词：水稻； bHLH蛋白；HLH蛋白；转录因子; 褐飞虱; 病原相关基因

1.背景

在无柄生长期间，植物需要处理由生物和非生物因素引起的各种环境胁迫。在数千年的进化中，植物通过激活一系列响应分子来响应这些压力（Baniwal等人，2004;Sunker，2010)。这些防御要素包括TF（Shi等人，2018; Viana等人，2018; Xiao 等人，2013），伴侣蛋白（Attallah等人，2007），促分裂原激活的蛋白激酶（Liang和Zhou，2018），活性氧（ROS）（Miller等人，2008），植物激素（Bari和Jones，2009;Peleg和Blumwald，2011; Santino 等人，2013），甚至是糖（Wingler和Roitsch，2008)。

bHLH蛋白是植物中最大的TF家族，可通过不同信号通路之间的串扰在植物发育和防御反应中广泛发挥作用（Ezer等人，2017;Kazan和Manners，2013)。 bHLH蛋白骨髓增生异常蛋白2（MYC2）参与JA调控的植物发育（Dombrecht 等人，2007), 根的形成(Chen 等人， 2011), 抗虫性(Schweizer等人，2013）和病原体反应（Kazan和Manners，2013）正在成为JA介导的响应的主要监管者。水稻OsbHLH148通过与OsJAZ相互作用参与JA信号传导并介导耐旱性（Seo等人，2011)。但是，HLH蛋白是bHLH家族中的一小部分非典型成员，缺乏基本结构域，通常与bHLH蛋白形成二聚体或多聚体并抑制它们的转录活性（Carretero-Paulet等人，2010;Li等人，2006)。在水稻中，粒长2（PGL2）的正调节剂通过影响细胞伸长并与bHLH蛋白拮抗剂Pgl1（APG）相互作用来调节粒重（Heang和Sassa，2012)。在拟南芥中，HLH蛋白ATBS1相互作用因子（AIFs）和与ILI1结合的bHLH（IBH1）分别与多效唑抗性（PREs）和细胞伸长因子1（ACE1）相互作用，形成HLH-bHLH复合物并介导油菜素甾体（BR）信号传导和细胞伸长率（Wang等人，2009），这种调节途径在水稻中是保守的（Zhang等人，2009)。水稻中的一项最新研究表明，HLH蛋白BR上调的1样（OsBUL1）通过形成OsBUL1 复合物来调节细胞的伸长（Jang等人，2017)。然而，尚不清楚HLH蛋白是否在应激反应中起作用。

褐飞虱（BPH）是一种水稻特有的食草动物，每年在整个亚洲的水稻种植区造成严重的生产损失（Cheng等人，2013;Flowers，2004)。JA和SA介导的信号传导途径已在针对病原体和昆虫的植物胁迫反应中得到广泛鉴定（Berens等人，2017)。通常，SA被证明可以积极调节水稻对BPH的防御（Yang和Zhang，2016)。尽管JA在抗BPH中的作用仍存在争议（Yang和Zhang，2016），越来越多的证据支持JA对BPH耐药的负面作用。例如，JA合成中，食草动物诱导的水稻2型13-脂氧合酶（OsHI-LOX）的沉默对BPH有抗性（Zhou等人，2009），并且9-脂氧合酶基因（Osr9-LOX1）的功能获得有利于BPH幼虫的存活（Zhou等人，2014)。 耐药基因Bph14和Bph29既可以增加SA途径中的基因表达，又可以抑制JA途径中的基因（Du等人，2009; Wang等人，2015)。然而，Bph6和Bph9可以同时激活SA和JA信号通路（Zhao等人，2016; Guo等人，2018），表明JA在不同背景下的特定作用也可能受到抗性基因的影响。尽管如此，JA和SA之间在介导BPH抗性方面的串扰仍然不清楚。

PR基因是免疫途径中的关键因素，并充当系统获得性抗性（SAR）反应的标志物（Glazebrook，2005)。稻瘟病显著诱导了几种PR1基因的表达（Mitsuhara等人，2008);以及表达高水平PR-1a蛋白的转基因烟草植物对病原体具有抗性（Alexander等人，1993)。一些PR1蛋白被证明具有抗真菌作用（Niderman等人，1995)。某些PR基因在SA信号转导中的表达在与细菌和稻瘟病的介导抗性中受病程相关基因1（OsNPR1）的非表达子的影响很大（Sugano等人，2010)。拟南芥单体NPR1可以进入细胞核并与直接调节某些PR基因转录的TGACG基序结合因子（TGA）相互作用（Chern等人，2014; Despres等人，2000; Zhang 等人，2003)。在水稻中，rTGA2.2可以与OsNPR1相互作用（Chern等人，2005），而rTGA 2.1负调控细菌性疾病和PR10基因（Fitzgerald等人，2005)。在强大的病原体诱导型启动子控制下携带OsAOS2基因的转基因水稻品系表现出对PR1a，PR3和PR5等PR基因的激活增强，并增强了对稻瘟病的抗性（Mei等人，2006)。同样，一些PR基因可能被BPH诱导（Hu等人，2017)。

以前，我们发现过，表达的烯丙氧化物环化酶（AOC）基因以JA独立的方式增加了对BPH的抗性（Guo等人，2014)。为了进一步揭示AOC介导的BPH抗性中的下游基因，我们鉴定了OsHLH61，其在AOC过分表达植物中被上调。功能分析表明，OsHLH61通过影响PR1，PR5和PR10基因的表达来积极调节BPH耐药性。OsbHLH96被证明是OsHLH61的相互作用因子，OsJAZ3可能与OsbHLH96相互作用。同时，OsbHLH96可能负调控PR基因的表达。因此，我们揭示了OsHLH61–OsbHLH96复合物在防御BPH中的作用，并增加了SA和JA串扰在防御BPH中的新观点。

2.材料和方法

2.1植物和昆虫

WT水稻品种为ZH11（中华稻11号中华种）。水稻植株在28plusmn;2℃的温室中生长，光照12小时/黑暗12小时，相对湿度70％–80％。BPH种群最初是从中国上海松江的稻田中获得的，并保持在温度控制在26plusmn;2℃，12小时光照/ 12小时黑暗周期和80％相对湿度的房间中或者在自然条件下的田间。

2.2 BPH性能测量

如前所述（Wang等人，2002，2012; Zhao等人，2016)。将大约3周阶段的每棵幼苗放在塑料笼中（直径4厘米，高8厘米，带有通气孔），并用12-18龄S-龄BPH若虫感染。每天观察植物的伤害水平，并在6-9天后将植物评分为易感（死）或抗性（存活）。

2.3构建

为了构建OsHLH61-RNAi质粒，扩增OsHLH61编码序列的273-bp基因特异性片段，并通过BamHI和KpnI以有义方向并将其以SacI和SpeI以反义方向克隆到PTCK303载体中。

为了构建OsbHLH96过表达质粒，将全长OsbHLH96克隆到pCambia1301-35SNOS载体的BamHI和KpnI位点，得到bHLH96OE质粒。

用pA7-YFP产生用于水稻原生质体转染的构建体，用pA7-HLH61-YFPF和pA7-HLH61-YFPR引物将OsHLH61 cDNA序列克隆到载体中。

为了构建OsHLH61p :: GUS质粒，将OsHLH61的2.27 kb启动子克隆到p1300GUSNOS载体中。

使用农杆菌介导的方法将所有用于遗传转化的质粒转化为ZH11（Hiei等人，1994)。 GUS活动已通过组织化学检测，如所述（Jefferson，1989)。

为了进行酵母双杂交分析，将OsHLH61和OsbHLH96的编码序列克隆到pGADT7和pGBKT7载体中，分别为OsJAZ1，OsJAZ3，OsJAZ5，OsJAZ7，OsJAZ9，OsJAZ11和OsJAZ12的编码序列。为了进行BiLC分析，将OsbHLH96和OsHLH61的编码序列分别读框克隆到771-nluc和cluc-772载体的KpnI和SalI位点。

对于Dual-Luc分析，将OsPR1a，PR1L，OsPR5，OsPR10a和OsAOS2的2 kb启动子克隆到pGreenII载体的KpnI和BamHI位点。bHLH96OE质粒和这些质粒用于Dual-Luc分析。

2.4水稻原生质体转化

水稻原生质体转化是通过使用聚乙二醇介导的转染进行的（Zhang等人，2011)。孵育16小时后，使用倒置共聚焦显微镜（Olympus FV1000）检测每种组合的YFP荧光信号。YFP荧光和叶绿素自发荧光信号分别在514 nm，527-532 nm和650-798 nm成像。

2.5植物处理

对于BPH处理，饥饿后2小时以2龄BPH若虫侵染约2周龄的植物，每只幼苗5个昆虫，在0、3、6、12、24和48小时后收集茎。对于植物激素处理，将水稻用二甲亚砜（DMSO）中的4 mL MeJA（400mu;M），OPDA（100mu;M）或SA（500mu;M）溶液喷洒，作为对照。在提取RNA之前，分别在0、0.5、1.5、3、6、12、24和48 h收集植物样品，并保存在-80℃下。

2.6实时定量PCR（qRT–PCR）分析

用14天大的WT植物的茎在BPH侵染植物前后检查靶基因的转录水平。使用三个独立的生物样品。通过使用Trizo（Thermo）分离总RNA。根据制造商的规程，使用First Strand cDNA Synthesis Kit（Toyobo）将1mu;g总RNA反转录。qRT-PCR用SYBR Green Real-time PCR Master Mix Kit（Toyobo）进行。泛素（Os03g0131300）用作内标来标准化cDNA浓度。

2.7数据分析

通过分析方差，然后进行t检验来确定不同品系或不同处理后的数据差异。所有测试均使用GraphPad Prizm（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)。

2.8 RNA测序和分析

收集未感染的HLHR4和ZH11植物以及BPH感染的HLHR4植物的幼苗，并提取RNA。构建文库，并在BGISEQ-500上进行了测序，并在北京基因组研究所帮助下进行（www.geno mics.org.cn，华大基因，中国深圳）。

2.9进化树建筑

使用MEGA 6.0（http://www.megasoftware.net/index.html）和具有以下参数的NJ方法：泊松校正，成对删除和自举（500个重复；随机种子）。

2.10酵母双杂交筛选

按照Clontech进行。载体pGBKT7-OsHLH61被转化为AH109而不是Y2HGOLD。将配制的培养物铺在缺少亮氨酸，色氨酸，组氨酸和腺嘌呤QDO（SD-LTHA）琼脂平板的培养基上，将培养基平板孵育3–5 d，然后将菌落放入新平板QDO中3–5 d。进行酵母菌落PCR，并对PCR产物进

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