线粒体自噬抑制阿尔茨海默病模型的淀粉样蛋白-beta;和tau病理并逆转认知缺陷

摘要：受损线粒体的积累是衰老和年龄相关性神经退行性疾病的标志，包括阿尔茨海默病(AD)。目前正在研究AD中线粒体内稳态受损的分子机制。本文提供了在AD患者的海马，在诱导多能干细胞衍生的人类AD神经元和动物AD模型中线粒体自噬受损的证据。在AD的淀粉样蛋白-beta;(Abeta;)和tau秀丽隐杆线虫模型中，线粒体自噬的刺激(通过NAD 补充、尿激素a和放线菌素)通过PINK-1(PTEN诱导的kinase-1)、PDR-1(与帕金森疾病相关-1；parkin)或DCT-1(DAF-16/foxo控制的胚系肿瘤影响-1)依赖的通路来逆转记忆障碍。线粒体自噬可以减少不溶性Abeta;1–42 和Abeta;1–40，并在APP/PS1小鼠模型中通过小胶质细胞吞噬细胞外Abeta;斑块和抑制神经炎症防止认知障碍。线粒体自噬的增强能够消除人类神经元细胞中与AD相关的tau过度磷酸化，并能够逆转转基因tau线虫和小鼠的记忆障碍。我们的发现表明，对有缺陷线粒体的移除受损是AD发病机制中的一个关键事件，因而线粒体自噬是一种潜在的治疗干预手段。

前言：线粒体产生神经元生存和发挥最优功能所必需的ATP，因此线粒体功能障碍与衰老和神经退行性疾病的发生密切相关。在AD中，神经元发生线粒体功能障碍和生物能赤字可能导致产生疾病，其最典型的病理现象是beta;淀粉样蛋白沉积和tau蛋白的过度磷酸化，相反地，beta;淀粉样蛋白和tau病理现象也会扩大线粒体缺陷。线粒体功能受损是AD的一个基本现象，因为它存在于散发性和家族性疾病的人类样本，以及转基因AD小鼠模型的脑组织中。在细胞水平，非糖基化全长淀粉样前体蛋白（APP）和C端截短的APP锚定在线粒体蛋白导入通道（线粒体导入受体亚基TOM40同源蛋白和线粒体导入内膜转位酶亚基Tim23），阻断了核编码线粒体蛋白的进入。线粒体功能障碍导致的能量缺乏和Abeta;1–42 寡聚体可引起细胞内钙离子失衡和5rsquo;AMP活化蛋白激酶的活化，导致突触毒性和记忆散失。此外，轴突运输线粒体对神经功能至关重要，Abeta;1–42 和p-tau蛋白在轴突转运过程中产生缺陷，导致突触形成饥饿，ATP耗尽，最终神经退化。因此，在线粒体损伤和这两种AD病理因素之间有着复杂的联系，研究表明，针对有缺陷的线粒体可能是AD治疗的一种重要方法。

线粒体质量控制受线粒体生物发生和线粒体自噬过程的调控。线粒体自噬包括将受损或多余的线粒体靶向到溶酶体，其中线粒体成分被降解并重新编码。在哺乳动物中，已有超过20种蛋白被报道为线粒体自噬的必需蛋白，包括pten诱导的激酶1（pink1）、parkin、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1（ULK1)、BCL2/腺病毒E1B 19 KDa蛋白相互作用蛋白三样（BNIP3L/NIX)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TBK1(TBK1)。与AD发病率随年龄增长而增加的同时，功能障碍的线粒体和线粒体自噬功能受损也随年龄增长而积累。重要的是，线粒体自噬通过维持一个健康的线粒体池和抑制神经元死亡，在神经元功能和神经元存活中起着至关重要的作用。然而，线粒体自噬在AD进展中的作用尚不清楚。利用死后的人类AD大脑样本，AD诱导多能干细胞（iPSC)衍生神经元和AD的转基因动物模型，我们发现AD中线粒体自噬存在缺陷。此外，在秀丽隐杆线虫和两只AD小鼠模型中通过抑制Abeta;斑块和p-tau可以恢复线粒体自噬并改善失忆症状。在此，我们提出有缺陷的线粒体自噬诱导功能障碍线粒体的累积，从而促进AD病理和记忆丧失，并提出这是药物治疗的一个方向。

图1 人类患者脑样本和 AD 患者 ipsc 衍生的培养神经元中的线粒体功能障碍和线粒体缺陷。

1. 从电子显微镜图像中定量例对 ad 患者和琼脂化健康对照的人海马组织中的线粒体参数进行定量;n = 来自 7个 AD 患者的300个线粒体或来自7个健康对照 (ctrl) 的203例线粒体。中心值表示平均值, 误差条表示. e. m. (* * * P lt; 0.001; 双面学生 t 测试)。
2. 代表性的一组电镜图像。
3. AD 患者和年龄匹配的健康对照在死后人类海马组织中 ampk 通路中所涉及的蛋白质的相对水平。
4. 使用 IHC 对线粒体蛋白 TOMM20 和溶酶体蛋白 LAMP2 的共聚进行定量。中心值表示平均值, 误差条表示. e. m. (n = 3个 ad 患者或3个健康对照组的9个随机字段; * * p lt; 0.001; 双面学生 t 测试)。
5. 在 AD 患者和年龄匹配的健康对照组之间使用电子显微镜图像对类似人丝分裂的事件进行定量。中心值表示平均值, 误差条表示. e. m. (n = 3个 ad 患者或3个健康对照组的9个随机字段; * * p lt; 0.001; 双面学生 t 测试)。
6. AD 患者死后人类海马组织中线粒体自噬的变化和年龄匹配的健康对照 (n = ad 组和健康对照组的7人)。
7. 来自 app 突变患者、APOE4 患者和健康年龄匹配控制细胞系 (28天分化) 的 ipsc 衍生神经元的代表性图像。
8. 对照行神经元 dendrite (核染色)、MAP2 (树突染色) 和 Tuj1 (神经元特异性 iii beta;-管蛋白染色) 的免疫荧光显微镜;刻度条, 50 微米。
9. 对照线神经元 DAPI (核染色) 和 BRN2 (皮质上层标记) 的免疫荧光显微镜;刻度条, 50 微米。
10. ipsc 衍生神经元中三个 ipsc 细胞系中线粒体自噬相关蛋白的水平。至少三个实验是独立重复的, 结果类似。所有印迹的完整扫描均在补充说明中

结果

AD患者海马样本和ADiSPC衍生神经元中线粒体自噬存在缺陷。为了揭示AD中线粒体损伤和受损线粒体累积的细胞和分子层面原因，我们研究了年龄和性别匹配的AD患者死后海马组织和健康个体间的神经元线粒体形态学（补充表1中的患者信息）。与健康对照组相比，AD样本中的海马神经元线粒体形态学发生改变，其特征是体积减小，线粒体损伤过度（图1a，b）。功能失调的线粒体缺乏能量产生，导致ATP的耗尽和AMPK的刺激，AMPK是一种进化上被认为能量消耗和线粒体稳态的主要调节因子。在野生型细胞（WT）中，活化的AMPK通过刺激线粒体分裂因子（MFF）来调节线粒体破碎，并清除有缺陷的细胞器以应对生物能量压力。在人类AD海马组织中，我们检测到AMPK及其下游效应物MFF的活性大幅增加（图1c和补充图1a中的定量）。有趣的是，通过线粒体蛋白质导入受体TOMM20同源亚基(TOMM20)与溶酶体相关膜糖蛋白2(LAMP2)蛋白的共定位和电镜下噬细胞样事件的定量检测，AD海马的自噬细胞基础水平比正常低30-50%（图1de和图1c的补充））。这些发现表明，AD患者海马线粒体损伤的积累是由线粒体自噬缺陷引起的。

AD中线粒体受损也可能发生，尽管AMPK激活和更小的线粒体的丰度，预计更容易通过自噬吞噬去除。为了解决这个明显的矛盾，我们系统研究了线粒体代谢和线粒体自噬的主要因素的蛋白水平。部分AD个体中线粒体自噬蛋白PINK1、bcl-2样蛋白13（Bcl2L13)和BNIP3L/NIX的含量都有所降低，所有人类AD样本中线粒体自噬起始蛋白 p-TBK1 (Ser172)和p-ULK1 (Ser555)均失活（图1f和补充图1b）。为了研究AD神经元中线粒体自噬是否受损，我们使用一个家族性AD突变体(APP/V717L)，一个散发性AD（脂肪蛋白E4(APOE4)/E4)和一个年龄和性别匹配的健康对照细胞系(SBAD03-01建立了ipsc衍生的神经元培养物（图1g-i）。使用一个良好的方案，我们产生皮质神经元，证明表达树突标记微管相关蛋白2(MAP2)，神经元特异性类别III微管蛋白制造者(Tuj1)，皮质上层标记脑特异性同源盒/pou结构域蛋白2(BRN2;图1h，i，健康对照神经元)。我们进一步证实了APOE4和app-来源的神经元中神经元特性的成熟，突触素(突触前终末的标志;补充图1d)和突触后密度蛋白95(PSD95，谷氨酸神经元突触后密度的标志;补充图1e)的表达证实了这一点。此外，我们发现，ADipsc衍生的神经元重现了人AD脑组织中的细胞特征，包括增加的DNA损伤(高h2a组蛋白家族，x信号成员)，线粒体内稳态受损(较低的sirtuin-1，pgc-1，和超氧化物歧化酶2，线粒体(SOD2))，线粒体断裂的增加(高的p-in-1动力性蛋白(DRP1)Ser616和p-MFFSer146)，以及低的ATP水平(补充图1e-h)。重要的是，与对照神经元相比，AD中的噬纤维蛋白TBK1和ULK1的磷酸化水平降低了50%以上(图1j和补充图1g中的量化)。。Psen1细胞来源的皮层神经元中p-TBK1(Ser172)的降低也是保守的(补充图1d)。此外，其他主要线粒体自噬蛋白的水平，如激活分子becn1调节自噬蛋白1(AMBRA1)，Bcl2L13，FUN14结构域含蛋白1(FUNDC1)，以及线粒体泛素连接酶激活因子NFKB-1(MUL1)在ADipsc衍生的神经元细胞中均有降低(图1j)。值得注意的是，AD神经元中自噬的基础水平降低(图1j中脂质修饰的微管组织蛋白轻链3(LC3B-II)和beclin-1的低水平，补充图1g中的定量)，这与以前的报道一致。此外，我们使用单体红色荧光蛋白荧光蛋白串联荧光标记的LC3质粒(ptfLC3)量化了自噬通量，数据显示，与对照组相比，APP神经元中自噬体和自溶体的数量减少(补充图1i)。这些结果表明自噬通量正常，但整体诱导的自噬途径减少。因此，我们在AD患者的海马样本和AD ipsc衍生的神经元中检测到了线粒体吞噬功能障碍。

神经元吞噬功能的恢复可以改善AD模型的认知功能下降。线粒体吞噬缺陷会导致线粒体受损、能量缺乏、炎症，最终导致神经元损失。因此，受损的线粒体自噬可能在AD病理中起重要作用，我们接下来研究通过药理学和遗传学干预激活神经元噬细胞是否会影响AD发病机制。我们建立了一个体内药物筛选平台，利用线虫鉴定潜在的神经细胞吞噬诱导剂，使用一个z评分标准。用两种不同方法检测vivo细胞的吞噬功能。首先，我们制备了表达泛神经元线粒体靶向Rosella(mtRosella)生物传感器的转基因动物，该传感器具有对溶酶体腔的酸性环境敏感的GFP变异，并融合到pH不敏感的盘状红色荧光蛋白(DsRed)中。为了验证这种方法的有效性，我们对携带神经元mtRosella的线虫在正常和吞噬条件下进行了测试。在正常条件下，野生型线虫神经元中同时存在GFP和DsRed事件(补充图2)。补充NAD 前体，如烟酰胺单核苷酸(NMN)，已知可诱导噬尘螨。事实上，NMN的补充导致mtRosella荧光的gfp/dsred比率下降，表明吞噬刺激(图2a和补充图2)。我们将DAF-16/foxo控制的胚细胞感染性受体(DCT-1)与绿色荧光蛋白(GFP)融合，与自噬体标记蛋白LGG-1融合，构建了表达DAF-16/FOXO-controlled胚细胞感染性受体的转基因线虫，并对NMN处理后的共定位事件进行评分。与mtRosella相似，NMN促进了DCT-1和lgg-1标记的自噬体的共同定位，表明神经元吞噬能力的提高(图2b，c)。接下来，我们使用我们的内部小型化合物库以及已知的自噬/吞噬诱导剂测试了一组化合物。本筛选鉴定了两种有效的神经元噬菌体诱导剂，一种是石榴中突出的小分子天然化合物uolithina(UA)，它能诱导肌肉细胞噬菌体26;另一种是抗生素actinonin(AC)，它能通过特异的线粒体核糖体和RNA途径诱导体外噬菌体27(图2a-c)。为了探讨UA和AC诱导神经元吞噬的分子机制，我们分别用UA和AC处理人神经元SH-SY5Y细胞，剂量为10ー100micro;M。UA增加了一系列与噬菌体相关的蛋白质水平，包括全长PINK-1(f-PINK-1)、parkin、beclin-1、Bcl2L13、AMBRA1和p-ULK1(Ser555)(补充图3a)。在体内，UA增加了app/ps1小鼠模型的F-PINK1(补充图3b)。Ac显示出与UA非常相似的效果(补充图3a，b)。在野生型线虫中，NMN-、UA-和ac诱导的神经元吞噬一直依赖于关键吞噬基因dct-1、pdr-1和pink-1(图2d和补充图2)。总之，我们的数据表明NMN，UA和AC通过进化保守的线粒体自噬机制诱导强大的神经元线粒体自噬。

为了确定线粒体自噬的相应贡献和我们研究中更一般的巨自噬，我们比较了NMN（5mM），UA（ 0.1mM）和AC（1mM）的剂量，我们发现它可以诱导强大的神经元线粒体自噬（图2a-c）。

在这些条件下，我们没有发现大细胞自噬的明显变化。Nmn(5mM)、UA(0.1mM)和AC(1mM)不能诱导线虫产生大自噬，表达与GFP或DsRed融合的自噬体蛋白LGG-1。我们检测了额外的自噬标记物，如LGG-1，LGG-2，和ATG-18(Atg18蛋白同源/wd重复结构域磷脂酰肌醇相互作用蛋白1)，与GFP融合于NMN(5mM)，UA(0.1mM)和AC(1mM)的几个组织中，发现一般的大型自噬在胚胎、肠道线虫、肌肉和细胞中没有诱导.总之，优化剂量的NMN（5mM），UA（0.1mM）和AC（1mM）特异性地诱导线虫中的线粒体自噬而非巨自噬。

为了研究神经元线粒体自噬对AD病理生理学的贡献，我们利用已经建立的线虫中的AD模型。表达泛神经元人Abeta;1-42（CL2355）蛋白的转基因线虫在正常和应激（百草枯处理）条件下通过较低的耗氧率（OCR）和降低的线粒体自噬来定义能量代谢缺陷（图2e-g和补充图3c ）。进行性记忆障碍是AD患者最常

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