PROC。 国家科。 科学院。 科学。 美国

卷。 84卷，4870-4874页，1987年7月

生物化学

通过使用萤火虫萤光素酶基因作为启动子活性的报道子确定花椰菜花叶病毒35S RNA启动子的功能区

（真核启动子/启动子元件/植物病毒/电穿孔/萤光素酶）

DAVID W. Ow *，JERRY D. JAcoest和STEPHEN H. HowELL

生物系，C016，加州大学圣地亚哥分校，拉霍拉，加利福尼亚州92093

1987年4月7日由Clarence A. Ryan传播（1987年2月5日收到）

摘要已将花椰菜花叶病毒（CaMV）35S RNA启动子解剖并在瞬时表达系统中使用萤火虫萤光素酶基因作为启动子活性的报道子进行检测。 删除分析显示35S RNA启动子至少由三个区域组成 - 远端，内侧和近端，这对活动是必不可少的。 远端区域含有与猿猴病毒40“核心”增强子元件同源的三个较小元件，内侧区域具有CCAAT样盒子，并且近侧区域包含TATA盒子。 包含远端区域的DNA片段能够以取向独立而非位置独立的方式激活CaMV 35S核心启动子。 远端区域也可以激活异源弱启动子，CaMV 19S RNA启动子，尽管不是35S RNA启动子的高水平。 远端区域的多聚体能够将35S RNA启动子核心激活至比天然35S启动子更高水平的表达。 这些实验证明，在植物细胞瞬时表达系统中识别核心启动子（由近侧和中间元件组成）边界外的元件。

已详细研究的真核启动子由多个顺式作用元件组成，这些元件是启动子功能所需的。 这些元件已经在DNA操作实验（缺失，诱变，接头扫描分析，元件重新定位等）中被识别并结合激活转录的反式作用因子（参考文献1和2）。 许多但不是全部的植物和动物启动子由TATA盒组成，其在转录起始点上游25-30个碱基处，通常是大约-80处的CCAAT盒，以及其他可以赋予启动子更大或调节活性的元件。 TATA盒为真核启动子建立极性; 结合蛋白质因子（3,4）; 并且序列，方向或位置的改变大大减少了完全转录或从正常起始位点（5）的转录。 CCAAT盒在启动子中发现其受到序列（5）改变的影响，在一种情况下（HY胸苷激酶启动子）以相对于转录起始的反向方向出现（6 ），并结合不同的蛋白质因子（7）。 其他上游元件可能因启动子不同而不同，推测可能结合不同的反式作用蛋白因子，这些因子可能赋予特定功能，例如高水平的组织特异性表达，组织特异性表达或对环境信号的反应（参考文献2） 。 结合转录因子SP1的元件被充分表征和

增强子，如SV40启动子72 bp重复序列中的那些，即它们可以以位置和方向无关的方式发挥功能，并能够赋予或调节异源核心启动子（10,11）。

广泛用于植物中嵌合基因构建体的启动子是来自花花叶病毒（CaMV）的35S RNA启动子。 该启动子驱动各种植物（12-18）的高水平RNA产生，包括远离宿主范围的植物，如单子叶植物（19）。 在病毒的背景下，35S RNA启动子是一个强大的启动子，并且必然如此，因为它驱动合成RNA，作为CaMV DNA合成的不可复制模板（20,21）。 CaMV还具有另一种启动子，即19S RNA启动子，其驱动合成编码最丰富的病毒编码蛋白质的mRNA（22,23）。

在本文中，我们进一步研究了35S RNA启动子，使用萤火虫萤光素酶cDNA作为瞬时表达分析中启动子活性的“报道”（24）。 荧光素酶催化荧光素的氧化脱羧，并在此过程中产生光（25）。 萤火虫萤光素酶测定法快速，便宜，灵敏，并产生定量结果（26）。 萤光素酶测定法非常灵敏，因为萤光素酶能够将化学能转化为高量子效率的光（27）。

方法

CaMV 35S RNA启动子的5-末端缺失。 质粒pDO432具有插入在含有CaMV 35S RNA启动子的上游DNA片段（相对于转录起始的-1585至 1）和含有下游片段的下游片段之间的萤火虫萤光素酶编码区

胭脂碱合酶聚腺苷酸化信号位点（24）。 使用独特的Ace I位点（-390）作为BAL-31消化的起始位点，并用T4 DNA连接酶将Xho I连接子连接至缺失末端点​​。 为了使缺失端点与常见的侧翼序列并置，用Xho I和HindIII（位点-1585）切割BAL-31消化的质粒，交错的末端用DNA聚合酶I（Kienow片段）填充，并且用T4连接酶封闭质粒DNA并用于转化大肠杆菌HB101。 Xho I和HindIII位点之间的平端连接恢复了HindIII位点，这允许快速筛选质粒以达到期望的缺失终点。 全部连接到pUC19质粒骨架的HindIII位点上的缺失端点通过双脱氧核苷酸

被发现在一些动物推动者，如那些在英国

猿猴病毒40（SV40）早期启动子（8,9）的21碱基对（bp）重复序列。 其他上游元素可以充当

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缩略语：SV40，猿猴病毒40; CaMV，花椰菜花叶病毒; DR，远端区域; MR，中间区域; PR，近端区域。

*现在地址：美国加州大学伯克利分校植物基因表达中心，美国加州奥尔巴尼市布坎南街800号，邮编94710。

t地址：西雅图华盛顿大学动物系，WA9819S。

使用反向测序引物（New England Biolabs，Beverly，MA）在双链DNA模板上进行测序。 35S RNA启动子远端区域的重定向或易位。 为了进入35S RNA启动子远端区（DR），用EcoRV（-89）切割并在-148处含有Xho I连接子的pJO62（其为pJO62d的祖细胞）并加入Sal I连接子重新封闭。 随后，将来自Xho I（-148）至Sal I（-89）的DR片段凝胶纯化并在截短的35S RNA启动子pJ044d（ - 73），pJO4x（-89），pDO478（ - 115）和pDO479

（ - 380）。 将DR部分从上游移动到更上游

-89启动子，通过Sal I连接子将850-bp NPT-II基因片段插入pJ062d的EcoRV位点（-89）以产生pDO625。 无DR区段的等基因质粒（pDO625）具有在Xho I接头处插入NPT-II基因

-89的pJO4x。 为了将DR片段置于萤光素酶基因的下游，首先将Sal I接头引入pJO4x的Kpn I位点（在3区段的聚腺苷酸化位点下游== 440bp）以产生pDO606。 随后，将DR片段插入pDO606的Sal I位点。

荧光素酶编码区与CaMV 19S RNA启动子的融合。 通过用来自pLW414的126或391-bp 19S RNA启动子片段替代pDO432中的CaMV 35S RNA启动子片段（28），将CaMV 19S RNA启动子与萤光素酶编码区融合。 延伸至 11的19S RNA启动子片段通过在CaMV基因组图谱上的位置5772处的寡核苷酸诱变产生的Sph I位点处插入Sal I接头（G.Baughman，每次个人通信）而在下游接入。 19S RNA启动子的上游侧通过在Pst I位点（-380;图位置5383）或EcoRI位点（-115;图位置5646）处引入Xho I接头进入。

瞬时表达分析。 使用从Fromm等人修改的电穿孔程序，用CsCl梯度纯化的质粒DNA转染来自胡萝卜蜡质悬浮细胞系W001C（来自R. Sung，University of California Berkeley）的原生质体。 （19）。 作为载体的质粒DNA（10-15mu;g）和超声处理的小牛胸腺DNA（500mu;g）与最终缓冲液体积为1.2ml的0.5-1times;10原生质体混合，并进行275V的100毫秒脉冲从一个320mu;F的电容放电。 在电穿孔18-20小时后通过在500mu;L提取缓冲液（100mM磷酸钾缓冲液，pH7.5 / 1mM二硫苏糖醇）中冷冻 - 融化3个循环，接着3秒超声处理来制备细胞提取物。 通过在4℃下在微量离心机中离心3分钟使提取物澄清。 荧光素酶测定缓冲液（36mM甘氨酰甘氨酸，pH7.8 / 20mM MgCl 2 / 12mM ATP / 1mg牛血清白蛋白）中加入0.05-0.1体积（25-50mu;l）超级浮游液每毫升），并通过将100mu;l0.4mM荧光素注入混合物来启动反应。 在连接到图表记录器的光度计（LKB，型号1250）中测量峰值光强度。

结果

CaMV 35S RNA启动子的结构。 为了定义CaMV 35S启动子中的功能元件，我们对来自CaMV基因组的DNA片段进行了5末端缺失分析，延伸了35S RNA帽位点上游1.6千碱基（29）。 通过使用寡核苷酸定向诱变将位点改变为BamHI位点GGATCC（G.Baughman，personal communication），获得35S RNA转录的起始位点（CGACAC，起始位点斜体）。 35S启动子片段在萤光素酶翻译开始上游80个碱基的BamHI位点与萤火虫萤光素酶cDNA连接。 在初步实验中，我们发现该区域延伸400

表1. CaMV 35S RNA启动子的5缺失的相对活性

删除 相对的

质粒 终点 活动 SD

标准化至pJO62d的相对萤光素酶活性是来自至少三次独立实验的六个或更多个样品的平均值。 标准差是人口标准差。

在转录起始位点至Ace I位点上游的碱基在完整的1.6千碱基片段在瞬时表达测定中是有活性的。 因此，我们从Ace I位点用BAL-31消化启动5缺失。

通过电穿孔将缺失的构建体引入胡萝卜细胞中，并且发现在瞬时测定中具有在位置-148之前或之前（相对于帽位点）的末端缺失几乎全部活性（表1）。 超过-148，更接近启动子，活动在两个点显着下降（图1）。 启动子活性急剧下降到完全活性缺失的20％，终点超过-134，并且在-89以外的缺失中，启动子活性急剧下降到完全活动的0.8％。

当启动子缺失的活性概况叠加在35S RNA启动子的序列上时，第一个活性下降发生在上游区域DR（图2）中，其含有与SV40同源的三个元件

“核心”增强器GTGQrAffG（30）。 在DR中的三个元素中，两个外部元素的方向是正向，中间是反向。

令人惊讶的是，删除至-134，消除了该结构域中5最多的元件，对启动子活性没有可检测的影响，但是至-108的缺失，消除了在相反方向取向的第二元件，对启动子具有深远的影响活动。

100

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-

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0

0

-1 48 -134 -108-104 -89 -73 -68

距转录起始点的距离（b）

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