研究脊髓形成、发育、功能和再生的非洲爪蟾模式生物

生理学与膜生物学系和儿科再生医学研究所，加利福尼亚大学戴维斯分校医学院，加利福尼亚州萨克拉门托市加利福尼亚大学儿童医院

摘要：脊髓是在脊椎动物胚胎发生期的第一个中枢神经系统结构，提现了其对生物体的重要性。 由于形成得早，无损处级羊膜发育中的脊髓比较困难，使用哺乳动物进行研究是非常局限的。相比之下，两栖动物，非洲爪蟾作为研究脊髓形成的模式生物，研究脊髓神经元和神经胶质的分化以及脊髓神经元和神经肌肉突触的建立过程中，可以很容易实现，并只对整个生物体的造成很少的干扰。基因编辑和显微镜以及已经完成的非洲爪蟾基因组测序使得这种经典模式更能清晰的阐明脊髓形成、发育、功能和再生的机制

关键词：神经管缺陷，脊髓损伤，形态发生蛋白，感觉运动反应，脊髓神经元分化，轴突诱导，钙依赖性活动，神经可塑性

介绍

模式生物的使用对于理解脊髓功能的进展是至关重要。青蛙一直是研究脊髓形成，脊髓细胞规格和分化，脊髓神经元轴突指导，神经肌肉接头形成和可塑性以及脊髓损伤和再生的先驱动物模式。

在两栖动物中，非洲爪蟾作为研究整个发育和成年期脊髓的有利青蛙品种，原因有这几个方面。首先，非洲爪蟾的卵的直径大约为1毫米，这意味着比最受欢迎的脊椎动物物种小鼠的卵大2300倍。能够简单的通过将已构建体微注射到卵子或受精胚胎中来进行基因表达和基因工程。其次，蛋壳是透明的，能通过非侵入性成像方法直接观察脊髓形态发生的第一阶段。第三，能在2-至32-胚胎阶段的个体卵裂球上进行微量注射导致镶嵌基因操作，使靶向基因异常表达进行内部对照或组织特异性。第四，非洲爪蟾脊髓的发育比啮齿动物快得多，发育速度可以通过在不同温度下生长来调节。第五，脊髓组织比高等脊椎动物要简单，脊椎细胞总数少，脊髓神经元类型少，两者之间的连接少。其脊髓细胞的主要种类是感觉神经元，中间神经元，运动神经元和神经胶质细胞。第六，这个物种在发育过程中表现出显着的再生能力，包括修复受损的脊髓，能鉴定较高的脊椎动物中可能缺失的成功再生脊髓的因素。尽管该物种具有独特的特征，但在细胞和分子水平上许多基本过程是脊椎动物中高度保守的，使非洲爪蟾（Xenopus laevis）成为研究人类疾病机制上有价值的有机体。

以上提到的非洲爪蟾属性特征是该物种成为研究神经诱导和脊髓形态发生，脊髓神经元分化，突触发生，包括神经肌肉接头形成和成熟以及突触的第一步的模型成功可塑性和脊髓损伤后的再生的原因。在这里，我们编译的开拓研究，在非洲爪蟾作为一个强大的生物模型来研究脊髓的发育和功能的各个方面，对促进研究脊髓可塑性与修复领域的发现和发展的机制作出了重大贡献。

脊髓线形成的第一步：非洲爪蟾的神经诱导

脊椎动物中的神经诱导是外胚层细胞子集以起始大脑和脊髓通过诱导细胞与相邻细胞层的相互作用而产生神经表型的过程（Spemann和Mangold，1924年）。这个事件发生在早期受精的胚胎和原肠胚之间，突显出产生神经组织的重要性在早期对生物体的成功。这个过程中涉及的第一个分子签名被发现是通过研究非洲爪蟾。通过评估组织特异性蛋白质的时空表达，开创性研究表明:非神经外胚层细胞表达一组从神经外胚层细胞中缺失的蛋白质（Akers等，1986）。相反，具体的表达神经细胞粘附分子（N-CAM）即同源盒转录因子XiHbox8，在非洲爪蟾原肠胚形成之后几个小时被鉴定出来（Jacobson and Rutishauser，1986; Sharpe等，1987）。例如，在中胚层与外胚层接触后，已经检测到N-CAM的mRNA（Kintner和Melton，1987），表明神经特异性蛋白质的表达是神经诱导后发生的步骤（Jacobson和Rutishauser，1986 ）。诱导组织的鉴定结果，支持中胚层和背外胚层之间相互作用的模型（Spemann，1938; Smith和Slack，1983; Sharpe等，1987）。这些相互作用是由非洲爪蟾中鉴定的两个中心组织，称为Nieuwkoop中心，位于背侧植物细胞中，其表达与Nodal相关的内胚层诱导剂和表达Chordin-和Noggin表达中心的背侧动物细胞，其包含未来的神经外胚层和Spemann组织者前体细胞（Kuroda等，2004）。

诱导细胞分泌的因子致力于神经表型包括Noggin脊索（Lamb等，1993），（Sasai等，1995），卵泡抑素（HemmatiBrivanlou等，1994），Xnr3（Hansen 1997），所有的抑制剂的骨形态发生蛋白（BMP）通路和成纤维细胞生长因子（FGF; Kengaku和Okamoto，1993）。信号引起的这些因素在背外胚层，包括蛋白激酶C（Otte等，1988,1991; Otte和Moon，1992）的信号分子如smad10和Smad1（Lesueur和Graff，1999; LeSueur 2002）在连接器领域，抑制其转录活性的核易位的磷酸化的膜和招聘易位，作为几个信号通路的整合（Pera等，2003）。

通过两个模型的创始研究，支持第一个外胚层细胞作为默认神经模型，通过抑制BMP途径; 在第二个模型中FGF指示背外胚层细胞变成神经。 最近，这两种模型的合并被提出（Marchal等人，2009）。通过BMP通路的显性负性（DN）辅因子的表达拮抗BMP信号，非洲爪蟾表皮被转化为神经组织。但是，当FGF4被敲除时，这被阻止; 此外，BMP信号传导抑制上调FGF4表达。这些发现导致统一模型神经诱导BMP抑制依赖，反过来激活FGF，指示神经表型调节剂表达（Marchal等，2009）。

驱动神经表型下游神经诱导的因素也已被非洲爪蟾（Xenopus laevis）的开拓性研究所证实，随后扩展到更高级的脊椎动物。突变转录因子是神经承诺的早期下游驱动因子，包括Zic3（Nakata等，1997），SoxD（Mizuseki等，1998b），Zic-r1和Sox2（Mizuseki等，1998a） 促进神经和神经元分化的神经元基因的表达，或者与其他途径协同起作用以启动神经表型的表达（Mizuseki等，1998a）。

在这个模型系统中，最近的研究揭示了神经诱导和早期神经规范过程中的新型参与者。诺里被确定为需要通过招募beta;-catenin和抑制BMP / TGF-beta;，从而协调这两个主要的信号通路（Xu et al.，2012）。对来鉴定当外胚层细胞被限制到神经身份时引起基因表达全局改变的机制做出努力。对爪蟾（Xenopus laevis）的研究中发现组蛋白甲基转移酶的活性对于控制神经诱导的基因表达的上调至关重要，可能是通过抑制Oct4相关的爪蟾基因Oct-25（Nicetto等，2013）。

通过非洲爪蟾属神经系统的神经突起形成脊髓

一旦神经外胚层被诱导，出现的神经板（其表现为外胚层的背部增厚）通过戏剧性形态发生事件转变成神经管，脊髓前体和脑。非洲爪蟾的研究再次照亮了细胞和分子机制介导神经管的形成。 相结合的生化信号和机械力的组织细胞形态的变化，包括心尖收缩和细胞伸长，为神经板弯曲时，神经褶海拔其次lateromedial迁移和细胞层，导致内外侧狭窄和神经组织前后延伸，延伸的过程称为收敛（为最近的综述见Sokol，2016）。

Apicobasal细胞延伸占神经上皮的增厚和变窄。此外，每层内的中外侧细胞插层使横轴的神经板变窄，同时在前后轴伸长（Keller等，1992a，b，c）。神经板成形紧随其后弯曲。最初，由于内侧铰点细胞顶端收缩，在凹槽内形成沟槽。然后神经板侧边缘上升形成初期神经褶皱。随后的折叠包括进一步的神经褶皱抬高，收敛和朝中线滚动。在这个阶段涉及持续的apicobasal伸长，细胞顶端收缩，在表皮下面的侧向神经板细胞爬行和继续mediolateral插入参与这个阶段。在神经板折叠细胞插入与成形阶段相比，以更高的速率发生，加速了神经上皮的会聚延伸（Jacobson等，1986）。随后，神经折叠尖端接触并在背侧中线融合（Davidson和Keller，1999）。最后，两个细胞层之间的径向插入形成单层神经管（Edlund等，2013）。

随着神经发育，神经上皮细胞中进行不同的细胞群，它表现出不同类型的细胞行为（Wallingford，2005）。 浅层神经板细胞的顶端收缩需要精确的细胞骨架和细胞粘附分子动力学的时空调节。 它是在非洲爪蟾发现，肌动蛋白结合蛋白蘑菇时是必需的，两栖类和哺乳动物神经管闭合通过与肌动蛋白丝和小GTP酶的Rap1招募富集根尖神经板表面诱导根尖狭窄（Haigo等人，2003）。 神经板细胞显示钙动力学（沃林福德等人，2001），其引起在这些细胞中的肌动蛋白通过瞬时收缩心尖池驱动收缩事件（Christodoulou and Skourides,2015）。

顶端收缩也需要在顶端神经板细胞膜上进行内吞（Lee and Harland，2010）。最近的一项研究表明，通过平板细胞极性通路的活动，在神经管形成过程中Rab11阳性的再循环内涵体定位于内侧顶端细胞连接处;这种极化是神经板折叠所必需的（Ossipova等，2014）。此外，我们实验室最近发表的一项研究表明，粘附分子钙粘蛋白的细胞内吞作用被破坏时的叶酸受体表达下调，从浅表神经板细胞顶膜，损害神经板细胞根尖狭窄和神经管的形成（Balashova等，2017）。该研究提供了在神经管形成期间叶酸作用的机制，解释了该过程对叶酸紊乱的易损性以及叶酸补充在预防人类神经管缺陷方面的益处（Blom等人，2006）。我们的研究，通过使用非洲爪蟾作为一个模型系统，揭示了叶酸及其受体的特殊功能超越其作为维生素和DNA合成的推动者，因为细胞分裂对非洲爪蟾属的神经管形成不是必需的（Harris and Hartenstein尽管叶酸/叶酸受体-1对于适当的神经板细胞顶端收缩和神经管闭合（Balashova等，2017）是必要的。

会聚延伸的过程发生在细胞伸长和插入，并且还依赖于Ca 2 动力学（Wallingford等人，2001）。另外，依赖于Dishevelled的非经典Wnt信号通路对于会聚延伸是必需的（Wallingford and Harland，2001）。 其他信号通路已经被鉴定为调节非洲爪蟾神经折叠升高和细胞插入的微管动力学所必需的是排斥性引导分子-Neogenin相互作用（Kee等人，2008）。 微管聚合也是目标的Zn2 转运蛋白ZIP12，当被撞倒时会损害发育中的脊髓神经元中爪蟾神经管的形成和轴突延伸（Chowanadisai等，2013;图1）。

脊髓神经元分化与脊髓成熟

脊髓功能的发展依赖于对脊髓神经元和神经胶质的特定身份的分配，随后建立突触连接。我们的目前对脊髓神经元功能分化的了解已经从非洲爪蟾的研究中得到了滋养。 Spitzer和Baccaglini的开创性研究（1976）研究发育中的脊髓神经元在体内和体外兴奋性的发展。他们发现神经管闭合后不久，Ca2 依赖性动作电位在体内未成熟的感觉脊髓神经元中被激发（Spitzer和Baccaglini，1976）。随着成熟的进行，动作电位依赖于Na 和Ca2 ，并且动作电位的Na 驱动成分逐渐变得更为主导，直到Ca2 依赖成分消失后，在受精后3天（Spitzer和Baccaglini，1976） 。在发育中的脊髓神经元中从Ca 2 依赖性向Na 介导的动作电位的转变取决于离子通道表达（ODowd，1983; ODowd等，1988）。在特定的延迟整流钾电流的上调是开关的关键（Ribera斯皮策，1989；汉堡和Ribera，1996；gurantz et al.，1996；Ribera，1996）。

神经元发育过程中钙离子依赖性动作电位的发现为钙离子介导的电活动在神经系统发育中的作用和机制开辟了一个引人注目的有影响的研究领域。在非洲爪蟾的爪蟾脊髓神经元的机制不成熟，自发的Ca2 的尖峰与T型Ca2 通道的激活（顾和斯皮策，1993）通过一个自发的去极化，最初似乎是由神经递质信号促进（根et al.，2008）。这个活动和脊髓神经细胞的分化成熟是重要的（顾和Spitzer，1995）。特别是，神经递质表型规范依赖于Ca2 秒杀活动的水平，以更高的频率驱动的抑制性神经递质和兴奋性神经递质表型频率较低的驱动的表达（Borodinsky et al.，2004；马立克et al，2010）。神经递质表型的变化都伴随着靶细胞包括骨骼肌神经肌肉接头的蝌蚪的神经递质受体的变化（Borodinsky斯皮策，2007；图1）。

我们从对图案的腹侧和背侧脊髓神经元的身份在非洲爪蟾的研究中了解到，这一过程中脊索的依赖；notochordless胚胎表现出较少的运动神经元和感觉神经元和中间神经元的轴突连合数高，越过中线在一个混乱的方式整体造成扰动的左右交替的运动行为（克拉克等，1991）。此外，在我们的实验室研究表明，钙离子介导的电活动与其他重要的发育信号通路像刺猬（SHH）和BMPs参与脊髓神经元的分化（belgacem和Borodinsky，2011, 2015；该和Borodinsky，2012；Borodinsky等，2015）。嘘增强脊髓神经元的活动（belgacem和Borodinsky，2011）而BMP抑制它（该和Borodinsky，2012）。这些研究发现了脊髓内形态蛋白作用的新的非经典信号通路。此外，我们发现，在脊髓发育的早期阶段，钙离子尖峰活性是Shh正则信号关闭的机制。（Belgacem和Borodinsky，2015），现象明显的是青蛙和老鼠（李et al.，1997；

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