山油柑属的系统发育及对其历史生物地理学和果实性状演化的初步认识

Laura Holzmeyer¹, Marco Duretto2, Darren Crayn³, Elvira Houml;randl¹, Margaret Heslewood²,

Janani Jayanthan³, Marc S. Appelhans^1,4*

1.植物分类学、生物多样性和进化部门，哥廷根大学，Untere Karspuuml;le 2，哥廷根，德国；2.新南威尔士国立标本馆、皇家植物园及域名信托基金，悉尼、澳大利亚；3.澳大利亚热带植物标本馆，詹姆斯库克大学，凯恩斯，澳大利亚；4.华盛顿特区史密森学会植物学系，美利坚合众国。

* marc.appelhans@biologie.uni-goettingen.de

摘要

背景

山油柑属（柑橘科，芸香科）包括49种乔木和灌木，它们主要发现于雨林。该属从亚洲大陆南部到澳大利亚和新喀里多尼亚均有分布，分布范围很广，但是大多数种都是新几内亚岛或澳大利亚的特有种。本研究旨在提供第一手详细的山油柑属的分子系统资料及用它来检测果实形态特征的分类学价值，并推断该属的历史生物地理学。

方法

系统发育分析（贝叶斯推理，最大似然法）运用了两质体（psbA-trnH、trnL-trnF）的核苷酸序列数据和29个山油柑属的种（占该属的59%）及相关属代表的三核标记（ETS, ITS, NIAi3）。

结果与结论

结果表明，东南亚属贡甲在系统发育上嵌套在山油柑属中，所以必须给予山油柑单系的异名。先前已经利用果实形态特征来推断山油柑属内的关系，并且我们的分析显示这些特征对于一些亚种而言是信息性的，但是对于整个种而言是同源的。心皮离生的果实在山油柑属中处于原始状态，衍生出半心皮离生和完全合心皮的果实。贡甲的单性花由两性花衍生而来，而两性花在所有的山油柑属物种及其亲缘植物中均有发现。山油柑属可能最先在澳大利亚演化，通过在萨胡尔大陆架内部的垫石扩散或直接土地连接向新几内亚扩展范围，然后在新几内亚西部地区进行两次独立散布。山油柑属的大部分物种要么出现在澳大利亚，要么出现在新几内亚，但这些物种没有同时出现在这两个地区。鉴于大陆的接近，这是令人惊讶的，但也可能用生态因素来解释。

引言

山油柑属主要属于芸香科柑橘属中的一个澳大利亚雨林属分支^[1,2]。该属49种被认可的物种可能是高达30米的灌木或乔木^[3,4,5]，它们叶单生或三生（两种性状可能发生在一个物种内），有八个雄蕊的花四面体，雌蕊发育成一个合心皮结构（有时只在基部）和核果类果实。尽管山油柑属的总体习性和花朵形状与近亲洋茱萸属，Medicosma，蜜茱萸属和Tetractomia相似，但具有不同蒴果或者囊状果实^[3,4,6,7,8]。

山油柑属的物种丰富度和特有性集中于新几内亚和澳大利亚东部，新几内亚有27种特有种，澳大利亚有19种特有种^[3,4,5,9]。很少有山油柑属的物种出现在这些地区之外，整体来看，该属的分布面积相对较大，主要是由于两个种：山油柑，分布于亚洲南部，从印度到台湾和整个马来西亚地区；以及A. trifoliolata，分布于爪哇和苏拉威西岛至所罗门群岛。澳大利亚东部广泛分布的一个物种是A. laevis，该物种也出现于新喀里多尼亚；虽然从豪勋爵岛的记录（例如，[3]）来看，该物种现在不被认为在那里出现^[4,10]。山油柑属的海拔范围是从海平面上升至3000米左右^[3,4]。

根据雌蕊室间开裂的有或无以及外果皮和中果皮的结构，山油柑属被细分为几个“进化线”（没有分类等级）^[3]。在山油柑属中，那些室间开裂、有一个（亚）肉质外果皮和中果皮的果实已经被认为是“原始”的，而那些完全合心皮、有一个（亚）木质中果皮和肉质外果皮的果实则为衍生^[3]。这个假设尚未使用分支系统学方法进行测试。Acronychia octandra在山油柑属中是独一无二的，具有几乎完全的离生心皮和喙心皮，它一直被认为“hellip;hellip;处于山油柑属进化的早期阶段。”（[11] p.445）。Acronychia octandra最初被描述为Euodia octandra，最近才被Hartley转移到山油柑属中^[11]。喙状的和心皮离生的核果以及外轮对萼花（有时雄蕊四枚为退化雄蕊）的组合则主要在新喀里多尼亚属Comptonella、Picrella和Sarcomelicope^[12,13,14]中被发现，这使得把A.octandra放到山油柑属中令人怀疑。

由于植物和花的形态相似，山油柑属、洋茱萸属和蜜茱萸属有着悠久的混乱的历史，这些属的许多物种有一个或两个其他属的同义词。然而，这三个属的果实形态显著不同，这导致Engler^[15]将它们分在了不同的亚科中：山油柑属被归为以闭果为特征飞龙掌血亚科，洋茱萸属和蜜茱萸属则归为以裂果为特征的芸香亚科。在二十世纪，大多数植物学家大量采用Engler的系统（例如，[16,17,18]），但是直到次生化合物的分析才为该系统的人为性提供了证据^{[19,20,21,22]}。分子系统发育的研究支持化学系统的研究并且表明，芸香亚科和飞龙掌血亚科在很大程度上是混杂的，而柑橘亚科则可以作为唯一的非单属亚科，可以被认为是单系^{[23,24,25,26,27,28 29,30]}。

山油柑属和它的裂果亲缘植物洋茱萸属和蜜茱萸属之间的密切关系是一个用Engler的系统分类芸香科的人为的最好的例子^[1,26]。除了洋茱萸属和蜜茱萸属外，还有有一群大约30个属，主要来自于亚洲和澳大利亚，被称为洋茱萸属联盟，可能是山油柑属的近亲^[31]。这些属中的大多数已经在最近的分子分析中取样，这表明洋茱萸属联盟不是单系^[1,2]。

山油柑属本身可能不是单系-贡甲被嵌套在它里面^[1]。贡甲是Hartley^[32]为三个东南亚物种建立的，他早先([3] p. 469)把贡甲排除在山油柑属外。现在山油柑属由六个物种组成，它们分布于东南亚大陆，从苏门答腊和马来半岛东至菲律宾^[32]。贡甲与山油柑在形态上非常相似，唯一一致的区别是单性花（贡甲）与两性花（山油柑），花瓣覆瓦状（贡甲）与花瓣镊合状（山油柑）^[32]。

在这项研究中，基于59%的物种的核和质体的序列，我们提出了第一个详细的系统发育重建山油柑属的方法，这59%的物种的选择覆盖了山油柑属的地理范围和形态多样性。本研究的主要目标是（1）重建山油柑属的系统发育史，（2）确定在山油柑属中与贡甲亲缘关系最近的物种以洞察种群雌雄异株的进化和贡甲的地理起源，（3）确定A.octandra是否是山油柑属的一部分，尽管它有不寻常的果实形态，（4）评价Hartley^[3]的进化路线的关联性，这个进化路线主要以室间开裂的有或无以及在山油柑属的分类中外果皮和中果皮的结构为依据，（5）确定生物地理格局，并推断山油柑属的分散方向和地理起源。

材料与方法

分类抽样

总体来说，目前公认为山油柑属的49个物种中有29个物种被包括在这项研究中，它们根据这个属的形态多样性和地理范围被全面采样。这29个物种包括19个澳大利亚特有种中的15个（79%）以及27个新几内亚的特有种中的10个（37%）。后者稀疏的采样是由于大多数物种（52%）只来自于模式采集或者来自于模式产地非常少的采集，模式产地在许多情况下是相当遥远的^[3,5,9]。对所有普遍的物种（即延伸到澳大利亚和新几内亚岛以外的地区）进行取样。Acronychia laevis分布于澳大利亚东部和新喀里多尼亚，但是从澳大利亚取材。贡甲属的一个样本被表明属于山油柑属^[1]，所以被列入分析。洋茱萸属被表明主要是Appelhans等人^[1]的蜜茱萸属/山油柑属分支的分支姊妹部分，因此洋茱萸属的七个物种中的两个物种(E.hortensis和E.montana) 被用作外群体。蜜茱萸属，Medicosma，Tetractomia和Comptonella以及山油柑属中亲缘关系最近的物种^[1]，都被包括在内，去评估E.hortensis和E.montana的单系。

本研究所使用的所有标本的凭证资料见表1和表2。

DNA提取、扩增和测序

实验室的工作是在凯恩斯、哥廷根大学和悉尼进行的。叶样品选自二氧化硅干燥标本或植物标本。植物材料是在TissueLyser II（QIAGEN公司，瓦伦西亚，加利福尼亚，美国）中用不锈钢珠进行研磨。使用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒（QIAGEN公司，瓦伦西亚，加利福尼亚，美国）根据制造商的指令（凯恩斯，悉尼）提取总DNA。在哥廷根实验室，原始协议被修改为两种方式：在没有RNA酶的情况下完成提取；裂解步骤从10分钟增加至30分钟以提高细胞壁裂解的效率。

表1.综合分析所用标本的凭证信息和GenBank登录号。植物标本的缩写根据Index Herbariorum （http://sweetgum.nybg.org/ih/）。A =山油柑属；C = Comptonella；E =洋茱萸属；M =蜜茱萸属；Ma =贡甲；Me = Medicosma；T = Tetractomia。星号（*）表示在本研究中获得的序列。

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