CIB1和CO相互作用介导开花的cry2依赖的调控

刘亚文，徐丽丽，马定邦，紫如晨，王佳伟，刘璐

摘要

隐花色素是光裂解样光感受器。拟南芥CRY2（隐花色素2）主要介导光周期花启动的调节。 CRY2已被证明可以促进FT（开花位点 T）mRNA表达来响应蓝光通过抑制CO蛋白质的降解（CONSTANS）和激活CIB1（CRY2相互作用的bHLH1）。虽然CIB1和CO都是FT的转录激活因子，它们的关系是未知的。在这里，我们展示了CIB1的物理交互与CO和促进FT转录的CO依赖方式。 CRY2，CIB1和CO形成响应的蛋白质复合物蓝光激活FT转录，复杂的是由光周期和黄昏时的峰值调节更高的FT表达。我们还确定CRY2是通过CIB1和CO招募到FT染色质，这三者都是蛋白质与FT启动子内的相同区域结合。因此，CRY2-CO和CRY2-CIB之间存在串扰途径，CIB1和CO共同作用来调节FT转录和开花。

关键词：CIB 1；CO；隐色素；开花时间；FT

主题范畴：发育分化；植物生物学；转录

介绍

隐色素（CRY）是与光解酶相关的蓝光受体在植物和动物中介导光响应.光激发CRY经历了几次生物物理和生化变化，包括环状电子转移，磷酸化，泛素化，和构象变化，以改变基因和蛋白质的表达转录水平和翻译后水平[4,5]。该拟南芥基因组编码至少两种隐花色素，即密码染色体1（CRY1）和CRY2。 CRY1的主要功能是介导蓝光依赖的去黄化反应，而拟南芥CRY2的主要作用是光周期调节花开始。

CO(Constans)和FT(开花位点T)是光和时间信号整合对光周期反应的重要调控因子之一。CO是一种转录调节因子，通过激活FT促进开花mRNA表达。FT是一种RAF激酶抑制蛋白，它通过从叶子迁移而充当长距离信号通过血管系统到顶端分生组织。FTmRNA的含量在开花时间中起着非常重要的作用。响应长日（LD）条件的FT转录激活是拟南芥开花光周期诱导的限制步骤。

已经显示CRY2通过抑制CO蛋白的降解和通过直接激活CIB1（CRY2-互作用bHLH1）转录因子来激活响应于蓝光的FT mRNA表达。CRY2稳定CO蛋白的能力可部分解释为CRY2-COP1（组成型光致形成1）-SPA1（PHYA-105抑制剂）复合物的轻微独立形成。 COP1是E3泛素连接酶，其靶向CO和几种其他转录因子用于降解，并且光引用CRY2与SPA1相互作用以抑制CO1的COP1依赖性降解。CIB 1是第一个被描述的蓝光依赖性CRY 2相互作用蛋白。它促进CRY依赖的开花

通过激活FT的转录的方式。CIB1（CIB2，CIB4和CIB5）与CIB1冗余地起作用以通过形成不同的异二聚体来激活FT转录。 所有这些同源物均正调节CRY2介导的光周期开花和FT转录。

虽然CIB 1和CO都是FT的转录激活因子，但它们之间的关系尚不清楚。在这里，我们证明CIB 1和CRY 2以CO依赖的方式促进FT转录和开花， CO可以独立于CIB。CIB 1和CO相互作用，共同诱导FT转录。在蓝光作用下，Cry2、CIB 1和CO形成一个蛋白质复合物。此外，CRY 2是 cbb 1和co被引入FT启动子，它们都结合在同一染色质区，因此cry 2-co和cry 2-cibs通路相互作用，调节FT转录和开花。

结果与讨论

cbb 1以CO依赖的方式促进FT转录和开花。

CIB 1是第一个被描述为蓝光依赖性的CRY 2相互作用蛋白，它以CRY 2依赖的方式促进FT的转录和开花。CO是另一种转录FT的活性催化剂，但它与CIB 1在FT激活中的关系尚不清楚。当我们在ft-1，co-1，co-2和gi突变体中过表达CIB1时，我们的结果表明，在ft-1和co突变体背部基因中，35S：Myc-CIB1的早期开花表型被废除了(图1A-C和EV1A-F)。这些结果表明，CIB 1对开花的促进作用既依赖于CO，也依赖于FT。此外，CIB1不能促进该公司的FT转录突变体背景（图1D和EV1G），即使CIB1的转录和蛋白质水平在共突变体中比在WT（野生型）背景中相似或甚至更高(图1D和E，EV1G和H)。FT-1是一个隐性突变体，突变位点位于171氨基酸(G171E)，导致FT蛋白无功能[23，24]， CIB 1也促进了FT在ft-1中的转录，尽管突变的FT是非功能的(图EV1G和H)。 CIB1不能促进ft-1和co突变体的开花背景不是因为ft-1和co突变体是晚开花，因为CIB1仍然可以促进开花和FT转录gi（GIGANTEA）突变体也是晚开花的(附录图S1a-E)。蓝光依赖性CRY2磷酸化，降解，以及CRY2和CIB1之间的相互作用不受GI蛋白影响，因为CRY2仍然被磷酸化和即使在gi突变体中也在蓝光下降解，而CRY2仍然存在可以与gi突变体中的CIB1共沉淀(附录图S2A和B)。有趣的是，CIB 1也能促进cop1-6突变背景中FT的转录， Myc-CIB 1/cop1-6表现出与cop1-6相似的早花期表型(附录图S3)。这些数据表明，CIB 1以CO依赖的方式促进开花和FT转录。

CO可以独立于cbs工作

拟南芥中约有170种bHLH蛋白。CIB1属于17名成员的bHLH亚家族18;这个家庭，CIB4，CIB5，CIL1和HBI1也参与开花，表明这些基因之间的功能冗余。事实上，虽然cib1 cib5 double和cib1 cib2 cib5三重突变体在光周期诱导条件下显示出显着的开花延迟，但在LD（长日）条件下没有，表达CIB1的显性阻遏转化的转基因系（CIB1） -EAR）在LD下显示出非常晚的开花表型（附录图S4）。当CIB1-EAR在共同突变体背景中表达时，它始终表现出晚开花表型并且与共单突变体相似地降低FT表达（附录图S4）。我们使用CRISPR / Cas9系统产生cib4c突变体[26]，然后制备cib1 cib3 cib5 bee1 bee3 cib4c hextuple（cibh）突变体（图EV2A和B）。 cibh突变体在LD条件下显示出显着的晚开花，尽管不如cry2突变体晚（图EV2C），而cibh突变体中FT的表达低于WT植物（图EV2F）。有趣的是，cibh突变体在35S：Myc CO植物中部分抑制早期开花表型和FT表达升高，尽管cibh和WT植物中CO的转录和蛋白质水平相似（图1F和EV2G）。 gi突变体不能抑制早期开花表型和35S中的FT表达升高：Myc-CO植物虽然是gi突变体表现出比cibh更严重的晚开花表型（附录图S1F-J），在我们的条件下，CO的表达模式不受GI的影响（附录图S2C），表明CO可以独立于CIB起作用，并且CIB可以调节CO活性。总之，这些结果表明CO可以独立于CIB起作用，而cibh可以减弱FT转录激活中的CO活性。

图1. CIB1以CO依赖性方式促进FT转录和开花，CO独立于CIB起作用。

A-J （A，F）52天龄（A）或25天龄的植物（F）表示在LD中生长的基因型。比例尺：5厘米。 （B，C，G，H）（A）（B和C），（F）（G和H）所示基因型开花时的开花时间和莲座叶数;数字表示独立的转基因品系。字母“表示”所示基因型的开花时间和叶数之间的统计学显着差异。 （D，E，I，J）qPCR结果显示所示基因型中CIB1，CO，FT的mRNA表达。数字表示独立的转基因品系。 Col中CIB1或CO或FT的转录水平设定为1.0。在ZT16从7日龄LD生长的幼苗收集样品。在（B，C，G，H）中，数据表示为平均值SD，每个基因型nle;15。 Ple;0.05（Tukey-HSD测试）。对于（D，E，I，J）中的数据，误差条表示三个生物学重复中的标准误差，并且对于这两个技术重复中的每一个进行。

CIB 1与CO共同表达

CIB 1以CO依赖的方式促进开花和FT的转录，CO可以独立于CIB。为了找出潜在的机制，我们首先检查它们是否影响对方的表达。我们的定量PCR结果表明，wt中cb 1的转录与co-1突变体的转录相似，wt和cb 1穗转基因株系中CO的转录也是相似的(图EV3A和B)。CIB 1和CO不影响彼此的转录。此外，使用在相似表达水平的不同互逆突变体背景中过表达CO和CIB1的转基因品系，我们发现CIB1和CO不会影响彼此的蛋白质稳定性WT，cibh和Myc-CIB1过表达株系中的CO的蛋白质水平或WT和co-1突变体中的CIB1是相似的(图2A-D和EV3C)。有趣的是，CIB1和CO都被发现受光周期调节并且共表达; 它们的蛋白质在早晨很早就达到了丰富的峰值，并且在具有FT表达的LD中在黄昏时再次达到峰值

(图2A-D)。

图2. CIB1和CO是共表达的。

A,B 免疫印迹显示在LD和LD下20小时内WT和co-1背景（A）或WT和cibh背景（B）中的CIB1（A）和CO（B）蛋白水平。 样品在10％SDS-PAGE上分离，印迹，用抗Myc抗体探测，剥离并用抗肌动蛋白抗体（ACT）重新探测。

C,D 如上所述计算在LD和20s期间WT和co-1背景（A）或WT和cibh背景（B）中CIB1（A）和CO蛋白（B）的相对水平（参见材料和方法）。误差条代表Western印迹的三个生物学重复的标准偏差。

图3. CIB1和CO直接交互。

A 荧光显微镜图像显示CIB1与核斑点中的CO共定位。 比例尺：2 lm。

B BiFC测定显示体内蛋白质相互作用。 将本塞姆氏烟草叶的表皮细胞与cCFP-CO和nYFP-CIB1，cCFP-CO和nYFP，或与cCFP和nYFP-CIB1共转化。 BF，明场。 合并，覆盖YFP和明场图像。 比例尺：50 lm。

C 分裂-LUC测定显示CIB1与CO相互作用。本塞姆氏烟草的叶表皮细胞与CO-nLUC和cLUC-CIB1或cLUC或nLUC与cLUC-CIB或cLUC共转化。

D 从10日龄35S：Myc-CIB1,35S：CO-Flag或35S：Myc-CIB1 / 35S：在LD中生长的CO-Flag幼苗制备的样品的Co-IP测定。

E 显示了该工作中使用的CO的示意图。 CO包含两个B-Box域和一个CCT域。

F 体外下拉分析显示CIBC和CO，或CIBC和CODN之间的相互作用以及CIB1C和CODC之间缺乏相互作用。 将His-TF标记的CO，CODN，CODC或His-TF标记的UVR8与从大肠杆菌中纯化的GST-CIB1C混合，并将His抗体用于体外下拉测定。 通过用抗CIB1C抗体或抗His抗体（UVR8，CO，CODC，CODN）探测的免疫印迹分析产物。

数据信息：对于每个实验，进行两次或更多次生物学重复

CIB 1与CO直接相互作用

因为CIB1在FT转录的诱导中依赖于CO和CIB1和CO共表达，我们检查了相互作用CO和CIB1之间。 CO和CIB1共同定位于细胞核中（图3A）; 因此，我们使用双分子荧光互补（BiFC）测定检查了它们在植物细胞中的相互作用。在用cCFP-CO和nYFP-CIB1共转化的细胞核中检测到强荧光，但没有荧光在用cCFP-CO或cCFP-CO分别转化的细胞中检测到nYFP-CIB1（图3B）。双分子发光互补（BiLC）测定证实CO直接与CIB1相互作用（图3C）。接下来，我们使用co-IP研究了CO-CIB1相互作用;我们的结果表明CO与CIB1共免疫沉淀（图3D）。此外，体外下拉试验表明CO的C末端与CIB1的C末端相互作用（图3E和F，以及EV3D和E，以及附录图S5），而CRY2与CIB1的N末端相互作用[17]。 co-2是隐性的在B-BOX上在氨基酸59（R59H）处具有点突变的突变体CO蛋白的结构域。与CCT域相互作用一致对于CIB1的C末端，体外下拉分析显示CO-2突变蛋白仍然可以与CIB1相互作用（图EV3D）。之前已经证明CO和CIB1与相似的区域结合在FT推动者。调查是否CO-CIB1可以在植物中检测到相互作用，因为它们都是结合的对FT推动者和DNA将它们拉在一起，我们做了一个共同的IP用DNase处理实验。我们的结果表明即使在DNA酶处理后CO CO也与CIB1一起沉淀，并且它们彼此相互作用而没有FT启动子（图EV3F）。 除CIB1外，CIB5通过BiFC测定显示与CO相互作用（图EV3G），表明多个CIB与CO相互作用。

图4. CO和CIB1促进开花和FT转录在一起。

A 28天龄的基因型植物表明在LD中生长。 比例尺：5厘米。

B,C （A）中所示的基因型开花时的开花时间和莲座叶数。 字母“a”至“c”表示所示基因型的开花时间和叶数之间的统计学显着差异。

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