编码SCAR-like protein2的早衰基因ES1影响水稻水分流失

原文作者：Yuchun Rao, Yaolong Yang,Jie Xu,Xiaojing Li,Yujia Leng,Liping Dai,Lichao Huang,Guosheng Shao,Deyong Ren,Jiang Hu,Longbiao Guo,Jianwei Pan,and Dali Zeng

单位：中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，杭州310006(Y.R.,Y.Y.,

J.X.,Y.L.,L.D.,L.H.,G.S.,D.R.,J.H.,L.G.,D.Z.);浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004(Y.R.,X.L.,J.P.);江西省农业大学作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西南昌330045(Y.Y.,J.X.)

全球干旱问题威胁到农业生产并限制了农业实践的可持续发展。在植物中，过度的水分流失会引起干旱胁迫并导致早衰。在本研究中，我们分离出了一个水稻(Oryza sativa)早衰突变体，命名为es1。es1-1的叶片在苗期出现水分流失(表现为叶缘白化、萎蔫)，在三叶期表现出早衰。我们使用图位克隆方法克隆到了ES1,该基因编码的SCAR-like protein2是cAMP类受体蛋白/威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白家族维普林-同源复合体的一个抑制因子。突变体es1-1的气孔密度明显增加，这导致了es1-1中水分流失过多，水流加快，同时也提高了根系的吸水能力和茎部的运水能力，促进了与水共同运输的金属离子在体内的富集。ES1在叶片和叶鞘中的表达明显高于其他组织，这与其控制叶片失水的作用相一致。GFP-ES1融合蛋白广泛存在于植物的细胞质中。总的来说，我们的数据表明ES1对于调节水稻的水分流失非常重要。

水稻(Oryza sativa)虽然是世界上最主要的粮食作物之一，但其种植耗水量也远高于大多数农作物 (Linquist等，2015)，据统计水稻种植用水量约占农业用水量的65%。水稻为约30亿人提供主食，然而确使用了世界上约24％-30％的淡水资源（Bouman等，2007）。严重的水资源短缺限制了水稻产量的进一步扩大，阻碍了现有稻田的灌溉(Zhu和 Xiong，2013)。克服水资源短缺的一个有效方法是减少水稻植株的水分流失，从而使这种重要作物能够在水资源较少的环境中种植（Nguyen等，1997）。

在植物中，叶片表面的气孔是水分排出和二氧化碳进入的主要通道，对蒸腾和光合作用等生理过程有强烈的影响。早期研究表明，一些基因的突变可能会影响气孔密度或分化，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的基因TOO MANY MOUTHS（AtTMM; Yang和Sack，1995），SCREAM2（SCRM2;Kanaoka等，2008），STOMATA DENSITY AND DISTRIBUTION1（AtSDD1;Von Groll等，2002）和编码促分裂原活化蛋白激酶的AtYODA2（Bergmann等，2004）。在生长发育过程中在，水稻叶片上的气孔呈正常分布（Huang等，2009），然而各种环境因素则会影响气孔的密度和大小以及水稻叶片的叶绿素含量。例如，水稻叶片在水分胁迫下的气孔明显少于水分充足条件下的叶片(Huang等，2009)。气孔密度和形态的变化影响水分流失(Boonruenget等，2013)。在水稻中，SIMILAR TO RADICAL-INDUCED CELL DEATH1通过调节气孔关闭来增强耐旱性(You等，2013)，而锌指蛋白DROUGHT AND SALT TOLERANCE的耐旱性和耐盐性则通过调节气孔孔径发挥作用(Huang等，2009)。在拟南芥中，保卫细胞中过表达的镁螯合酶H亚基通过促进气孔关闭来赋予耐旱性(Tsuzuki等，2013)。因此，气孔关闭和低气孔密度通过减少植物的水分损失来增强耐旱性。

植物表皮蜡质层是抵御环境条件的第一道屏障，它能减少由于蒸腾作用造成的水分损失和防止由于过度强光而对植物造成损害(Riederer和Schreiber, 2001)。叶片蒸腾包括气孔蒸腾和角质层蒸腾。气孔导度控制气孔的蒸腾作用，而叶片表面的理化性质主要控制角质层的蒸腾作用。例如，角质层蜡的组成、厚度和微观结构影响水的渗透性和输运(Svenningsson, 1988;Xu等，1995;Buschhaus和Jetter, 2012)。水稻DROUGHTINDUCED WAX ACCUMULATION1、GLOSSY1和WAX SYNTHESIS REGULATORY GENE1通过调节角质层蜡的沉积或生物合成影响抗旱性(Islam等，2009;Wang等，2012;Zhou等，2013;Zhu和Xiong，2013)。

此外，叶毛状体也会影响水分流失(Konrad等，2015)，叶毛状体与肌动蛋白细胞骨架密切相关。肌动蛋白细胞骨架参与控制毛状体中细胞的定向扩张已引起广泛关注(Zhang等，2005)。一般来说，可以通过筛选叶片毛状体突变体来研究影响细胞质组织的基因(Qiu等， 2002)。在拟南芥中，一个可复制的形态发生程序指导毛状体分支的极化发育（Mathur等，1999；Szymanski等，1999；Le等，2006）。其中一些基因影响细胞骨架并影响正常植物细胞的形态，尤其是表皮细胞。例如，拟南芥中SPIKE1的突变使表皮细胞呈现出简单的排列和形态(即所有细胞沿单一轴分裂;Qiu等，2002)。

为了研究水稻失水的分子机制，我们分离并鉴定了水稻早衰突变体es1-1，该突变体表现为过度失水和早期衰老表型。基于图位克隆结果表明，ES1编码了SCAR-like protein2，其拟南芥同源物影响肌动蛋白的聚合。突变体es1-1在叶片毛状体中表现出明显的变化，与拟南芥相似。然而，很少有研究报道肌动蛋白细胞骨架与拟南芥失水之间存在联系。我们的结果表明，肌动蛋白细胞骨架在调节水稻水分流失方面发挥着关键作用。

结果

早期衰老突变体的鉴定与表征

为了研究水稻衰老的机理，我们利用EMS进行诱变，筛选了粳稻品种日本晴（NPB）背景下产生的大量突变体。从这个池中，我们鉴定出两个具有早期衰老表型的突变体。两个突变体在相同的生长条件下表现出相似的表型，且两个突变体杂交产生的F1个体表现出与弱型表型突变体类似的表型（随后命名为es1-1；见下文），表明这两个突变体是等位的（补充表S1）；因此，我们将这些突变体命名为es1-1和es1-2。在正常生长条件下，es1-1植物表现出严重的发育迟缓。在苗期，es1-1突变体表现为叶尖发白、发黄(图1A)，是早衰的标志(Li等，2014);该表型随着叶龄的增加而加重，到抽穗期变得更为严重（图1B）。新发育的叶片边缘变黄，向内卷起或形成螺旋形，老叶出现锈斑，颜色生锈，水分缺乏，表现为枯萎（图1A-B）。组织化学分析显示，es1-1叶片中过氧化氢、超氧化物自由基、丙二醛等衰老相关物质的浓度高于野生型叶片(图1C-D)，说明突变体确实具有衰老表型(Moradi和 Ismail, 2007)。此外，我们在野生型和突变体中测量了两个衰老标记基因STAYGREEN和Os185的表达（补充图S1、F-G）。我们发现这两个基因在es1-1中的转录水平明显高于野生型，这表明es1-1导致植株衰老（Lee等，2001；Park等，2007）。此外，我们还测量了植株高度，发现从幼苗期到成熟期，es1-1明显短于野生型植株(图1A-B;补充表S2)。在成熟期，es1-1突变体表现为退化或白色圆锥花序，结实率较低 (仅2.4%;图1 E;补充表S2)，短节间(图1F;补充表S2)，和棕色、开放的颖片(图1G)。透射电子显微镜显示，与野生型中观察到的整齐有序的类囊体相比，es1-1具有无序的类囊体; 此外，es1-1的叶绿素含量低于野生型日本晴。

与es1-1相比，es1-2植株分蘖更多（补充图S1，A和C），更高（补充图S1，A和D），并且在叶中显示出更强的早衰表型（补充图S1.B）。 在本研究中，我们主要关注es1-1突变体，除非另有说明。

图1 野生型和es1-1的表型。A、苗期植物。野生型(cv NPB左边)和es1-1(右边)。标尺= 3厘米。B、抽穗期植株。野生型(左: cv NPB)和es1-1(右)。标尺= 10厘米。C、氮蓝四唑(NBT)染色(上:cv NPB，左: es1-1，右)和二氨基苯胺(DAB)染色(下: cv NPB，左; es1-1右)。D、幼苗期丙二醛(MDA)含量(cv NPB，左; es1-1，右)。E、圆锥花序轴(cv NPB，左; es1-1,右)。标尺= 5厘米。F、叶在不同部位(cv NPB，左; es1-1，右):从左到右，顶部的节间长度，顶部的第二个，顶部的第三个，顶部的第四个。标尺= 3厘米。G、晶粒尺寸(NPB，顶部; es1-1底部)。标尺= 1毫米。H、透射电镜观察叶绿体(cv-NBP，顶部；es1-1，底部)。标尺= 0.5 毫米。

ES1的图位克隆

为了明确es1-1表型是由一个基因或多个基因显性或隐性基因引起，我们将突变株之间、突变体与三个野生型品种进行了反向杂交。所有F1植株均未出现早衰症状。在这三个杂交组合的F2分离群体中，正常和早衰植物表现出3:1的典型分离比（补充表S3）。该结果表明es1-1的早衰表型由单个隐性核基因控制。

为了克隆ES1，我们将突变体es1-1 (粳稻)与典型籼稻南京6 (NJ6)杂交。从F2代鉴定出es1-1表型的植株作为初始定位群体。在初步定位中，我们利用分布在水稻12条染色体上、相距10 - 30厘米的164对SSR引物，检测es1-1与NJ6的差异。在1号染色体上的SSR标记M1检测到显著的扩增差异，表明在F2代小群体存在连锁。利用标记M1进一步分析F2群体中的320个突变体，检测到15个交换株。遗传连锁分析发现M1标记距离ES1仅2.3cM（图2A)。

为了精确定位ES1, ES1必须锁定在两个分子标记。因此，我们在相对远离M1的位置设计了多对引物(补充表S4)。检测发现标记M6在es1-1和 NJ6之间也表现出多态性。筛选初定位群体(320个突变体)，鉴定出11个不同于M1鉴定的交换株(图2A)。连锁分析将M6标记映射到距离ES1 1.8 cM的位置。接下来，我们用M1和M6对整个种群(2,850株植物)进行筛选，分别鉴定出50和39个重组体(图2A)。

为了进一步缩小ES1区域，我们在M3和M4之间设计了大量的STS和dCAPS标记。引物C1到C9在ES1-1和NJ6之间表现出良好的多态性。因此，我们利用这些引物对初步筛选得到的交换株进行分析，构建ES1的精细遗传和物理图谱(图2B;补充表S4)。C1和C10检测到的交换株分别为28和35。同样，C2和C9筛选到的交换株分别减少到10个和12个，C3和C8检测到的交换株进一步减少到3个和4个。C3和C8检测到的结果分别对应于不同的植株。

我们还在C3和C8之间的区域设计了引物，以进一步筛选基因两侧的交换单株。最后，这些新的引物只检测到一个交换株；因此，这些标记物与ES1紧密分离（图2B）。末端标记C5和C6之间的物理距离为13.1kb，其中包括两个预测的开放性阅读框。

与野生型序列相比，序列分析检测到es1-1 13.1-kb区域内的LOC_Os01g1040有一个独特的突变，这个A到G的单碱基替换发生在第三个内含子的第一个核苷酸（核苷酸2275；图2C）。为了检验这种突变是否改变了第三个内含子的正常剪接，我们用逆转录法扩增了es1-1和野生型的cDNA，测序显示，es1-1 的cDNA比野生型长62个碱基（图2D）。这种长度的增加与第三个内含子的长度一致，第三个内含子包含一个终止密码子，导致蛋白质翻译提前终止(图2E)。同样，测序分析显示，es1-2突变为核苷酸4,660时的单碱基取代(G到A)。该突变将Trp密码子改变为一个终止密码子，从而导致蛋白翻译提前终止(图2E)。

图2 ES1的图位克隆，以及ES1 -1互补转基因株系的表型。A、es1-1在水稻1号染色体上的位

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