镉胁迫下水稻幼苗叶片相关性状的新QTLs分析

原文作者: Jiahui Wang¹ · Yunxia Fang¹ · Bin Tian¹ · Xiaoqin Zhang¹ · Dali Zeng² · Longbiao Guo² · Jiang Hu² · Dawei Xue¹

单位：

¹ College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou，China

² State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou，China

摘要：镉（Cd）是一种非必需的有毒金属，在过去几十年中主要是通过人为污染释放到环境中。为了研究水稻苗期耐镉性的遗传机制，在镉胁迫条件下，采用卷叶(LR)和绿叶率(GLR)这两种与镉有关的性状对水稻进行QTL分析。利用粳稻JX17和籼稻ZYQ8杂交获得127个加倍单倍体（DH）群体的水稻品系，在LR上定位到2个QTLs（qLR-1和qLR-9），在GLR上定位到1个QTL（qGLR-3）。其中，qLR-1和qGLR-3位点可解释表型变异率分别为19.27%和16.09%，这对选育耐镉的优质水稻品种有一定参考价值。研究也进一步表明，在镉胁迫条件下，对幼苗性状中LR和GLR进行可视化鉴定是筛选耐镉水稻品种的有效方法。

关键词：水稻；QTL；镉；叶片卷曲；绿叶率

1 介绍

镉(Cd)作为一种非必需的重金属，在过去几十年中主要是通过人为污染释放到环境中，没有任何有益的生物作用；镉释放的常见来源包括镍镉电池、采矿、金属电镀、城市废物和商业磷肥的滥用(Gupta and Gupta 1998)。2014年，中国两部委(中华人民共和国环境保护部和中华人民共和国国土资源部)联合发布了一份报告。报告从2005年到2013年，对630万平方公里的土地进行调查，并整理相关数据。这些数据概述了中国目前的总体土壤质量状况。中国中南部和西南部大部分地区已经确认存在重金属污染，其中Cd、Hg、As、Cu、Pb、Cr、Zn和Ni的水平分别超出规定的法定限值7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、0.9%和4.8%。作为这份报告的结论，镉被确认为是这些地区最突出的有害污染物(Zhao et al. 2015)。与其他被调查的重金属相比，镉对这些地区的农业生产构成了潜在的威胁，因为它从土壤到植物的迁移率很高，而且即使是非常低浓度的镉也对植物发育具有高毒性，可显著降低作物的产量和质量（Anjum et al. 2015）。

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的主要粮食作物之一，特别是在亚洲（Mishra and Panda 2017；Vivitha et al. 2017）。因此，研究水稻镉积累和耐镉性的遗传机制是培育耐镉品种的关键。最近的研究已经鉴定出水稻Cd代谢过程中一些不同的QTLs（数量性状基因座）和基因，并随后进行克隆和研究（Sebastian and Prasad 2014）。在研究中发现，与Cd积累相关联的主要QTLs和LCD的克隆基因在12条染色体上都存在（Ueno et al.2009； Xue et al. 2009；Ishikawa et al. 2010；Norton et al.2010；Zhang et al. 2011；Huang et al. 2017），（Shimo et al. 2011），OsAUX1（Yu et al. 2015），OsHsfA4a（Shim et al. 2009），Ospdr9（Tan et al. 2017），OsWJUMK1（Agrawal et al. 2003）和OsZIP1（Ramegowda et al. 2013）在1号染色体上，OsO3L3（Wang et al. 2016），OsNAAT1（Inoue et al. 2008）和OsYSL2（Koike et al.2004）在2号染色体上，OsCDT1（Kuramata et al. 2009），OsIRT1（Yang et al. 2016），OsIRT2（Nakanishi et al. 2006），OsMAPK2（Yeh et al. 2004），OsMSRMK2（Agrawal et al.2002）和PEZ1（Ishimaru et al. 2011）在3号染色体上，SO1（Qin et al. 2016）在4号染色体上，OsMTP1（Yuan et al. 2012）在5号染色体上，OsHMA2（Takahashi et al.2012），OsHMA9（Lee et al. 2007），OsLCT1（Uraguchi et al.2011），OsMSRMK3 （Agrawal et al. 2003），OsO3L2（Wang et al. 2016） 和OsPCS2 （Das et al. 2017）在6号染色体上，OsABCG43（Oda et al. 2011），OsHMA3（Miyadate et al.2011），OsNramp1（Takahashi et al. 2011）和OsNramp5（Ishikawa et al. 2012）在7号染色体上，OSISAP1（Mukhopadhyay et al. 2004）在9号染色体上，OsHIR1（Lim et al.2014）和OsPCR1（Wang et al. 2015）在10号染色体上。这些基因在镉的吸收、积累、转运、信号转导和耐受性方面发挥着不同的作用，凸显这种生物学困境的复杂性。

镉对植物的毒性使得植株高度、叶片和分蘖数、叶绿素含量和总生物量下降，这主要是由于光合作用器官受到损害、碳水化合物代谢中断和正常矿物营养途径受阻所致( Moya et al. 1993；Larsson et al. 1998；Cao et al. 2015；Zhang et al. 2015 )。QTL分析是鉴定主要QTL位点的一种有效方法，它突出了金字塔式育种的分子标记( Talukdar et al. 2017 )，但在标记辅助选择(marker assistance selection, MAS)过程中，这些次要的精英基因往往丢失。为了确保优质水稻的育种工作，MAS通常与抗性筛选相结合，特别是在实验室环境中。LR和GLR已被确定是水稻幼苗镉耐受的两个重要指标，它们的使用将有助于镉的抗性筛选。本研究的主要目的是分析镉耐受的分子遗传学，鉴定主要的QTLs，以促进MAS的发展。再继续深究，以更全面地阐明镉耐受背后的遗传机制，并克隆相关调控基因和获取分子育种标记，以便更精确地筛选出高产抗镉水稻品种。

2 材料和方法

2.1 植物材料

以粳稻品种京系(JX17)和籼稻品种窄叶青8 (ZYQ8)杂交的水稻品系为试验材料，利用F1代花药培养技术构建加倍单倍体DH群体，共获得127个DH株系，种子在杭州中国水稻科学研究院常规田间栽培下收获。

2.2 培养条件

将DH株系和亲本的种子用3％H ₂ O ₂溶液灭菌10分钟，用去离子水漂洗5次，在28℃的黑暗条件下用去离子水中浸泡2天，在30℃下发芽1天。 最后在30℃/ 16小时光照，28℃/ 8小时黑暗循环的培养室中培养2周。 在此之后，选择长势一致的的水稻幼苗移植到含有营养液的塑料容器中（Yoshida et al. 1976）继续培养4周，然后将等量递增剂量的CdCl₂加入营养液中培养5天，以达到最终浓度 100mu;molL^-1。

2.3 性状测定

在镉胁迫条件下培养7天，按照Turner发表的方法(Turner 1997)将水稻植株卷叶(LR)表型按1 (无卷曲) ~ 5 (严重卷曲)分级。在镉胁迫下培养7天后，再进行7天的恢复生长，随后进行绿叶率(GLR)评估计算：GLR(%)= TLN / GLNtimes;100。TLN和GLN分别表示总叶数和绿叶数。

2.4 数据分析和QTL定位

使用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。使用83个SSR和160个RFLP标记去构建遗传连锁图谱，结果如先前报道的那样均匀分布在12条染色体上（Xu et al. 1998）。 利用QTLMapper 1.60软件通过遗传作图进行QTL分析，并计算P值、LOD阈值，染色体，标记区间，解释变异和加性效应等遗传参数。评估的QTLs是根据McCouch等人提出的系统命名法命名的（1997）。

3 结果和讨论

叶片是水稻主要的光合器官和呼吸器官。适度的LR（卷曲）可以通过促进叶片直立增加水稻产量，从而改善光接收面积、降低疾病发生率和延缓衰老（Lang et al. 2004）。除了这种卷曲频率的自然遗传变异之外，当植物细胞中镉的水平改变内部水势和渗透调节时，叶片卷曲可对镉胁迫产生应答，从而导致叶细胞肿胀减少（Hsiao and Turner 1984；Ouzounidou et al. 1997）。此外，叶片黄化也是镉胁迫的一种毒性症状，是由叶绿素损失引起，并导致生长迟缓（Ouzounidou et al. 1997；Hsu and Kao 2007）。

到目前为止，关于水稻镉积累的研究报道比较多（Sebastian and Prasad 2014；Xue et al. 2014；He et al. 2017；Zhao et al. 2017）。为了有效地鉴定水稻对镉的耐受位点，迄今为止对水稻进行了大量的QTL分析。Ueno等（2009）利用来自Badari Dhan（高镉积累增加）和Shwe War（低镉积累增加）的F2群体，在染色体2、5和11号上定位到三个积累Cd的QTLs。通过自交系的反交，获得F7群体。Kashiwagi等(2009)在染色体4和11号上定位到与镉浓度相关的3个QTLs。Xue等(2009)利用镉胁迫和对照条件，在1、2、3、5、6、7、8、9和10号染色体上定位到22个QTLs，这些QTLs与株高(SH)、根长(RL)、茎干重(SDW)、根干重(RDW)、总干重(TDW)和叶绿素含量(CC)相关。Ishikawa等(2010)在7号染色体短臂上定位到与籽粒Cd积累相关的1个主要QTL。Norton等(2010)在叶片的1、3、6号染色体上定位到与镉浓度相关的3个QTLs，在籽粒的1、2、3、7、9、10号染色体上定位到与镉积累相关的6个QTLs。Abe等（2013）利用LAC23/Koshihikari染色体片段置换系，在染色体2、3、5、6、7、10和12上定位到与低镉含量相关的8个QTLs。Yan等（2013）在染色体10、3、9、11和5上分别鉴定了5个主要效应QTLs（scc10用于芽的镉积累，gcc3、gcc9和gcc11用于籽粒的镉积累，sgr5用于芽粒分配比）。然而，目前对水稻幼苗叶片耐镉相关性状的QTL分析很少。

在我们目前的研究中，DH群体在镉胁迫条件下GLR和LR的分离值是连续分布的（图1；表1），两个性状的峰度和偏度均小于1，表明这两种表型遵循正态分布的模式（图1；表1）。因此，拟合DH群体中这两个性状进行QTL图谱分析，共鉴定出3个QTLs--qLR-1、qLR-9和qGLR-3(图2；表2)。在这些QTLs中，2个与LR性状相关的qLR-1和qLR-9，分别被定位在1号染色体的TCT125--RG400之间和9号染色体的C356A--CT522之间，且分别占可解释表型变异率的19.27%和8.18%。与GLR性状相关的qGLR-3 被定位在3号染色体的C63--CT125之间，占可解释表型变异率的16.09%(图2；表2)。在JX17和ZYQ8杂交产生的DH群体中，Guo等 (2004)曾在干旱胁迫条件下，分别在染色体1、5和11上检测到关于LR性状的3个不同的QTLs，但在qRL-1的邻近位置发现了一个关于相对含水量的QTL --qRWC-1。同样，利用相同的DH群体，Xue 等(2009)定位了一个QTL--qSH-9，qSH-9控制芽高，其也被定位C356A-CT522之间，与qRL-9的定位区间相同。Srividhya等（2011）在PEG诱导的胁迫下和对照条件下，定位到19个与苗期干旱相关的QTLs，其中4个QT

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