多孔玉米淀粉中乳酸杆菌的封装研究

HaitengLi¹, VanThiThuyHo¹, MarkS.Turner^1,2， SushilDhital³，

1. 农业与食品科学学院，昆士兰大学，圣卢西亚，昆士兰州4072，澳大利亚; 2.营养与食品科学中心，昆士兰农业与食品创新联盟，昆士兰大学，圣卢西亚，昆士兰州4072，澳大利亚; 3. 研究植物细胞壁卓越中心，营养与食品科学中心，昆士兰农业与食品创新联盟，昆士兰大学，圣卢西亚，昆士兰州4072，澳大利亚）

摘要：本研究以澳大利亚国产玉米淀粉或部分水解玉米淀粉为原料，在酸、胆盐、热处理后，对原生物植物乳杆菌299v微胶囊的存活进行了研究。通过扫描电镜和共聚焦扫描激光显微镜证实，天然玉米淀粉中天然存在的孔洞和通道被酶水解后，使其充满益生菌。使用改性淀粉的配方与天然淀粉在冻干后相比，具有明显更高的初始活性细胞。与游离细胞相比，微胶囊化益生菌在耐酸方面有显著提高。在比较改性淀粉和未改性时，酶处理并没有显著提高相对存活率，但在暴露于酸（ph=2,1h),胆汁盐（3%，4h)和热处理（60^.c,15min)后显著提高了总活菌数。这些结果表明，多孔玉米淀粉颗粒具有较高的益生菌负荷效率，并能够比自由的细胞提供更强的保护。

关键词：益生菌 ；益生元；封装；改性淀粉；乳酸杆菌

1 介绍

近年来，益生菌纳入功能新食品越来越普遍。其对促进胃肠道健康起着重要的作用^【1】。在许多食品中添加了乳酸杆菌299v，主要是发酵的牛奶，因为它具有公认的健康特性，如肠易激综合征^【2】和血管内皮功能的改善^【3】。然而，这些应用受到了益生菌细胞生存能力的限制，细胞的存活受到加工和储存条件以及GIT环境的影响^【4】。为了在体内发挥功能性作用，益生菌食品应该含有足够数量的活菌（＞10^7CFU/g）^【5】来发挥益生菌作用。采用各种载体材料和制备工艺，对益生菌的封装进行了研究。广泛研究了藻酸盐、壳聚糖、果胶、卡拉胶、乳清、明胶和脂类等食品级聚合物来固定细菌^【6】。其原理是形成一个特别强的分子网络来包裹细胞，挤压和乳化技术通常被应用于产生海藻酸钙胶囊。虽然海藻酸水凝胶囊被发现对保护益生菌在胃环境和储存期间有积极作用，但由于海藻酸盐单独形成的颗粒具有相对较低的机械稳定性，在螯合剂的存在下，益生菌的捕集不稳定。所以应结合其他聚合物改善海藻酸钠胶囊的稳定性^【7】。

缓慢消化或抗胰酶的淀粉具有一种益生菌作用，这对促进肠道菌群的生长和随后在体内的健康是非常有益的^【8】。血糖控制和肠道健康的改善与可发酵的膳食纤维的正常摄入有关^【9】。此外，选择淀粉粒小、颜色白、风味温和的淀粉，可为食品应用提供具有吸引力的感官特征。

封装是获得益生菌和酶抗性淀粉的合成效果的最佳途径之一^【10】。发现高直链淀粉玉米淀粉能提高双歧杆菌对低pH和胆汁酸的耐受性。海藻酸凝胶小球中淀粉的加入为益生菌提供了协同保护^{【11】 【12】}，然而，关于多孔颗粒淀粉作为一种封装材料的知识仍处于起步阶段。

为了获得进一步的功能性能和提高性能，淀粉粒可以被改性成多孔胶囊，具有药物传递、风味诱捕等工业应用。玉米淀粉中的气孔、通道、孔洞等结构特征，提供了一个可扩展的空间^【13】，可以在淀粉酶消化后充满细菌。与马铃薯淀粉相比，该结构增加了有效表面积，并促进了相对较高的酶解敏感性^【14】。因此，玉米淀粉比马铃薯淀粉更易被酶消化改性成多孔胶囊。目标核心材料可以被物理吸附在孔隙和空腔中，而不存在共价键，吸附分子可以在一个持续的模式下完全释放^【15】。同样值得注意的是，部分水解的玉米淀粉仍然像未经处理的原生淀粉一样缓慢消化。这表明它可以用于定向输送到大肠，玉米淀粉的酶消化过程在特定表面积的大小上有3-4倍的变化^【16】。因此，多孔玉米淀粉可以提供一种理想的内表面，以便在加工过程中加入益生菌。然而，还需要进一步的研究来了解多孔淀粉的微观结构对含益生菌的胶囊性能的影响。通过控制淀粉材料的制备，可以更准确地在消化道中传递。

在本研究中，采用不同酶处理的改性玉米淀粉作为壁材，包裹乳酸杆菌299v。对改性的壁体材料和益生素淀粉胶囊的形貌进行了表征。此外，研究了微胶囊中益生菌菌株的稳定性，并在温和的热处理条件下进行了简单的刺激。

2材料和方法

2.1益生菌菌种的获取

材料益生菌菌株299v是通过一种com-mercial益生菌胶囊获得的，并通过16s rDNA测序确认为正确的物种^【17】。然后接种在MRS液体培养基中摇床培养（37.C,24h),然后取菌液于离心管中，置于离心机中离心（4400r.10min)，无菌水洗涤两次，再加入0.2%无菌钠磷酸（PH=6.3)中获得大约 10^-10 CFU mL -1益生菌菌悬液。

2.2 多孔淀粉的制备

胰腺a-淀粉酶(PA [A6255 Sigma])，胰酶(P [P- 1750sigma])，真菌a-淀粉酶(FA [10065 Sigma])被从美国的sigmaaldrich公司购买。应用这三种酶和两种处理时间(30 min和120 min)对本地玉米淀粉(22.2%直链淀粉，澳大利亚)进行改性。，淀粉浆(5% w/v)用PBS (s - aldrich, USA)缓冲液制备，并将酶(0.5单位/ mg的淀粉)与淀粉悬浮液混合。在不添加酶的情况下，将样品置于50毫升的管中，用磁性搅拌器连续搅拌（250times;g）使水浴的温度保持在37。C，经过30,120 min这两时间点后，通过离心管离心（4000r,5min)获得多孔淀粉。然后残留物清洗三次，用过量的乙醇去除可溶性糖和残留酶。最后，淀粉质沉积物被转移到培养皿中，在40.C的真空炉中烘干。每一种处理都准备两批。经过准备的这些材料被称为P30、P120、PA30、PA120、FA30、FA120和Native。通过释放麦芽糖测定30min时淀粉的水解度为18%-22%，, 120min时水解度为36%-41%。然而，在不同的时间点，酶的水解度并没有显著的不同。

2.3益生菌细胞的封装

益生菌细胞根据 Lahtinen,Ouwehand, Salminen等描述的方法^【18】被封装在准备好的玉米淀粉中。首先细菌培养(6毫升)转移到含有2.0 g淀粉的无菌试管中，并使用轨道振动器（600times;g）搅拌(澳大利亚Labtek) 3小时，然后混合物沉淀2小时，上清液仔细地过滤掉，沉淀物被放置在培养皿中，在冷冻（-20。C）前冷却4小时，最后冷冻干燥一夜。在涂层材料中，将淀粉(2% w/v)加热，在加热板上加热15分钟，直到形成凝胶。沉淀物冷却至室温后，凝胶溶液与冻干粉混合(3毫升g -1淀粉)。以糊化淀粉为原料制备淀粉浆料，并进行再结晶静置（-20。C）一夜，再冷冻干燥24h。之后，将微胶囊置于无菌10毫升试管中在4.C之前测试。封装过程是重复的，分别使用两批准备好的淀粉。

2.4益生菌可行性鉴定

微胶囊(0.10 g)首先加入0.9 mL包含有胰液素(0.5单位/毫克淀粉）蛋白胨水(0.1% w/v)。胰酶被添加到淀粉中，释放被包裹的细菌，胶囊悬液在轨道振动器(澳大利亚的Labtek，600times;g)上旋转15分钟得到所需的样品。用蛋白胨水(0.1% w/v)和0.1 mL样品进行连续稀释，分别从三个适宜的连续稀释剂中扩散到琼脂培养基上，琼脂板在无氧条件（37^。C）培养36h,在MRS培养基中培养，计算出益生菌数量并记录.（形成单位(CFU),适宜平板菌落数为15-300个）。细菌生存能力的损失计算如下：

减少可行的细菌= log N ₀ -log N其中，N₀和N分别表示在治疗前后(酸、胆、热)菌数。

2.5抗酸和胆汁盐性能测定

根据Ding and Shah的方法对微胶囊和游离益生菌的酸、胆盐胁迫生存实验进行了研究^【19】。将游离的菌悬液（9.46 logCFUml^-1）进行对照,酸的配置，将含有5M Hcl的MRS溶液的PH调节到2.0，高温高压灭菌，灭菌后在超净台上检测其PH值，若PH值上升则加盐酸调节。，将制好的微胶囊（0.1g)与0.1ml游离菌分别置于含有0.9ml盐酸试管（2ml)中，采用乳化技术，在37^。C时乳化1h和2h,置换用1MNaOH来中和酸。

胆汁盐的配置，含有3% (w/v)牛胆汁盐(澳大利亚化学供应)的MRS，使用5.0MHCl调整pH 为5.8。将制好的微胶囊（0.1g)与0.1ml游离菌分别置于含有0.9ml胆盐试管（2ml)中,采用乳化技术，在37^。C时乳化2h和4h。为了测定活菌，微囊需分离出来，细菌从淀粉中释放出来，如第2.4节所述。对于游离的细菌，漩涡仪30s,，目的是分散在乳化过程中形成的细菌簇。采用第2.4节中描述的方法对活细胞进行计数。对于每一批微胶囊，分别进行复试。

2.6耐热性

根据 Mandal, Puniya, and Singh对微胶囊和游离细菌进行了轻度热处理稳定性的评价实验^【20】。0.10 g微胶囊或0.10ml自由细胞悬液接种到0.90ml钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.3)试管(2毫升)中，经过加热器（60^。C，15，min)处理，试管冷却至室温（23^。C左右），如第2.4节所述方法，检测到活细胞。

2.7共焦激光扫描显微镜检测

使用共聚焦激光扫描显微镜观察益生菌的分布情况，L7012(分子探针trade;,俄勒冈州,美国)。细菌材料按照制造商的协议染色。干粉(- 10mg)在显微镜载玻片上轻轻混合10 m l的染色混合物(SYTO 9和支持pidium碘荧光染料)，并盖上一个玻片。在黑暗中染色30分钟后，用488 nm激发波长观察样品。然后，放大目标(油浸)。

2.8多孔淀粉的形态观察

用扫描电镜观察酶处理后淀粉的形态结构。将干燥的样品分散在圆形金属管上，上面覆盖着双面碳带，在氩气环境中覆盖大约5纳米的铂。这些图像是使用飞利浦XL30扫描电子显微镜(Phi- lips, Eindhoven，荷兰)在5kv的加速电压下获得的。

2.9统计分析

对每个独立批次重复样本进行分析，每批重复试验的平均值在分析显著差异之前(p lt; 0.05)在Minitab 17中使用Tukey同时进行测试。所有的实验数据表示为 plusmn; S.D.

3结果

3.1微胶囊的微结构

在扫描电子显微镜下观察了原生和部分水解玉米淀粉的微观结构（图1）。图像证实酶的作用导致了圆形和多角形颗粒的多孔结构的形成。无淀粉酶处理的原生淀粉的表面(图1 B)保持松弛，没有表现出明显的漏洞，说明控制的预定量对其形态没有影响。在高倍镜下，可以看到原生颗粒上的一些微小凹陷和裂纹^【13】在酶消化后，观察到气孔的大小和数量(图1 C-H)。不同来源的淀粉酶处理的淀粉的表面孔隙和孔径大小在视觉上相似，水解程度也相一致。在酶处理期间，孔的连通性增加，形成了较大的气孔。

图1所示。淀粉粒的扫描电子显微图(A)和酶解后:控制(B)、胰腺A -淀粉酶(C、D)、胰酶(E和F)、真菌A -淀粉酶(G、H);30分钟消化(C、E、G)和120分钟消化(D、F、H)

采用共聚焦显微镜和核酸染色法观察益生菌在淀粉材料中的分布。多孔淀粉颗粒清晰地显示出“内部”的水解模式^【13】，在膨胀的孔洞中增加了绿色荧光细菌(图2 B和C)。而未经修饰的淀粉只吸收表面的细菌(图2A^【22】。有1-2 um长度的绿色荧光细菌被SYTO9(绿色)染色，但未被PI(红色)染色，这表明细菌膜并没有渗透到PI的较大分子中，这表明细菌菌是可行的。在改性淀粉中可以观察到相对较高的细胞负载，尽管在封装过程中使用了相同的细菌悬浮。如图2 A所示，在颗粒表面有少量细菌粘附，表明乳酸杆菌299v并不是玉米淀粉高度粘附的菌株。在透射光下，淀粉粒内的微结构120 min水解淀粉粒显示出比30分钟处理颗粒更大的腔体。观察结果与SEM图像(图1)一致，淀粉颗粒在消化后的深度增加，持续时间较长。

图2所示。(B) 30分钟水解微胶囊和(C) 120-min水解微胶囊(箭头示大孔孔口)。

3.2微胶囊化后的活细胞数

通过酶的修饰(表1)，微胶囊化过程后封装的细胞数得到了明显的改善。在所有改性淀粉中，初始细胞数量约为9 log CFU g -1，而本地淀粉则为7.77 log CFU g -1。结果表明，改性淀粉具有较高的细胞负荷。然而，在不同的多孔淀粉中没有显著差异(p gt; 0.05)。

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