比较代谢组学揭示了喜马拉雅山区两种濒危的红豆杉（喜马拉雅红豆杉和云南红豆杉）之间的代谢变异

原文作者：Chunna Yu1,2, Xiujun Luo1,2, Xiaori Zhan1,2, Juan Hao1,2, Lei Zhang3 , Yao-Bin L Song1,4, Chenjia Shen1,2* and Ming Dong1,4*

摘要

背景：由于天然产物紫杉醇（一种成功的抗癌药物），红豆杉属植物引起了广泛关注。 喜马拉雅红豆杉和云南红豆杉是两种主要分布在喜马拉雅山脉的濒临灭绝的红豆杉。在我们的研究中，应用了一种与靶向UPLC-MS / MS方法相结合的非靶向代谢组学方法来检测在不同环境中生长的这两种红豆杉物种之间的代谢变异。

结果：云南红豆杉中的紫杉醇水平远高于喜马拉雅红豆杉，表明云南红豆杉对紫杉醇的生产具有较高的经济价值。确定了一系列特定代谢物，包括前体，中间体，紫杉醇的竞争者。所有鉴定的中间体主要在云南松中积累而不是喜马拉雅红豆杉，对云南红豆杉中紫杉醇的较高积累给出了合理的解释。红豆杉及其类似物在喜马拉雅红豆杉中高度积累，其可能消耗有限的中间体并阻止代谢流向紫杉醇。总黄酮和大多数测试的单个黄酮类化合物的含量在喜马拉雅红豆杉中显着积累而不是云南红豆杉，表明喜马拉雅红豆杉具有更强的环境适应性。

结论：系统代谢分析可为不同环境下生长的两种濒危类红豆杉种质资源的综合工业利用提供有价值的信息。

关键词：黄酮类化合物，种质资源，代谢产物，代谢组学，红豆杉，紫杉醇

背景

红豆杉，针叶树或灌木的植物称为紫杉，是各种生物活性化合物的主要来源，如紫杉醇及其衍生物[1]。通用的紫杉醇，以注册商品名Taxol销售，该产品是其中之一。 最成功的抗癌药物在过去几年中使用[2]。 紫杉醇的市场需求超过了供应量，受限于几种限制性条件，如野生紫杉的生长缓慢，低紫杉醇含量和复杂的合成途径[3]。已经揭示了紫杉醇的生物合成途径，产生了大量的紫杉醇前体，中间体和衍生物[2]。 首先，质体2-Cmethyl-D-赤藓糖醇磷酸酯途径提供3单位的C5类异戊二烯前体异戊烯二磷酸和1单位二甲基烯丙基二磷酸合成二萜紫杉烷核心香叶基ge牛儿基二磷酸[4,5]的前体[4,5]。 紫杉烷骨架的形成是由香叶基香叶基二磷酸环化产生的，产生的分类为-4（5），11（12） - 二烯，由重要的酶紫杉二烯合成酶介导[6,7]。 然后，几个中间酶促反应如羟基化，乙酰化和N-苯甲酰化发生在途径中[2]。 例如，10 deacetylbaccatin III（10-DAB）的乙酰化是生产浆果赤霉素III的必要步骤，浆果赤霉素III是紫杉醇生物合成的先进前体[8,9]。 此后，将C13侧链附加到浆果赤霉素III上以形成N-去苯甲酰基-2-脱氧倍他索[10,11]。紫杉醇生物合成的最后步骤由侧链N-苯甲酰基转移酶进行，使用N-去苯甲酰基紫杉醇作为 实际基质[12] 已经鉴定出超过500种紫杉烷二萜类化合物，包括脑苷，7-表10-去乙酰紫杉醇和7-表紫杉醇[13-15]。最近，紫杉烷类新颖已经从不同红豆杉species.For例如，taxezopidine J和红豆杉pine d分离自东北红豆杉，从T.红豆杉的树皮中一个新的紫杉烷葡糖苷的种子，从T的树皮两个新的重排的紫杉烷二萜类化合物wallichiana和三种新的紫杉烷二萜类化合物，即浆果赤霉素VIII，IX和X，在过去的二十年中，从云南松的种子中发现了[16-19]。有趣的是，中间氧化步骤产生了广泛的紫杉醇类代谢物，这些代谢物被认为是死端代谢物，不能用于紫杉醇的生物合成[20,21]。一种非靶向代谢组提供了一种系统分析和比较其特征的捷径。物种间的主要和次要代谢物[22]。自2003年以来，已对红豆杉属中的代谢组进行了研究，分析了有或没有茉莉酸甲酯处理的T.培养基培养物的差异代谢物[23]。 2009年，使用代谢分析工具揭示了T.cuspidata细胞对剪切应力的防御机制[24]。还使用代谢组学方法研究了T. mairei培养幼苗中紫杉烷合成的波动[25]。该代谢组学分析数据阐明了在茉莉酸甲酯处理下控制紫杉醇及其前体生物合成的关键网络[26]。在不同溶解氧条件下对T.chinensis细胞的整合代谢组学和转录组学分析表明，溶解氧转变引起的紫杉烷产生变化与细胞中心碳代谢的全局变化之间存在关联[27]。

最近，综合蛋白质组学/代谢组学分析揭示了短期高剂量紫外线（UV）-A辐射在促进T. mairei中紫杉醇产生中的重要作用[28]。

迄今为止，已鉴定出约14种红豆杉属; 然而，不同物种和品种的累积紫杉烷水平可能存在显着差异[29,30]。 喜马拉雅红豆杉和云南红豆杉是两种生长缓慢和濒临灭绝的物种，主要分布在中国西南部[31]。

对这两种形态相似的红豆杉物种之间的紫杉烷以及其他次生代谢产物的种间差异积累的代谢特征的研究，可以促进产量最高的物种繁殖，并揭示物种和环境依赖性代谢的机制，变化。 此外，喜马拉雅山脉是世界上为数不多的稀有植被天堂之一。 我们的研究可能为保护这两种濒临灭绝的红豆杉种类的种质资源提供有价值的信息。

方法

植物材料

在吉隆（中国西藏东经29°22，东经95°26）的15种独立的10年生野生红豆杉（红豆杉 tree）收获新鲜枝条样品，并在墨脱（28°28）收获云南松（云南红豆杉）。 N，85°13E，西藏，中国），分别（图1a）。 吉隆的平均海拔高度为4,000米墨脱的平均海拔高度为1200米。

标准和试剂

紫杉醇（PTX;ge;99％），10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB;ge;98％），浆果赤霉素III（BAC;ge;99％），芹菜素（API;ge;98％），槲皮素（QUE;ge;98.5％），木犀草素（LUT;ge;98％），山奈酚（KAE;ge;98％），（ ） - 儿茶素（CAT;ge;97％）和（ - ） - 表儿茶素（E-CAT;ge;98％）从阿拉丁生化技术（中国上海）获得。 10-去乙酰紫杉醇（DAP; 98％），7-表紫杉醇（7-E-PTX; 98％），amentoflavone（AMF; 98％）和银杏黄素（GKG; 98％）购自J＆K Scientific（中国北京）.7-Epi 10-去乙酰紫杉醇（7-E-DAP）购自Toronto Research Chemicals（Toronto，Canada）。

Cephalomannine（CEP;ge;98.5％）由MUST Bio-Technology（中国成都）提供。 甲醇（HPLC级）和甲酸（HPLC级）得自Merck（Kenilworth，NJ，USA）。

代谢物提取用于非靶向代谢组学分析

将来自两个红豆杉物种（每个25mg，n = 15）的枝条样品转移到微量管中。将等份的800mu;L预冷却的50％甲醇加入到管中。 使用2010 Geno / Grinder（SPEX SamplePrep，Metuchen，NJ，USA）以1,900次/分钟的速率将混合物研磨2分钟。 将样品与500mu;L预冷的氯仿/甲醇/水（v：v：v，1：3：1）混合，在4℃下在黑暗中涡旋15分钟，并在5分钟内超声处理5分钟。 冰。 在4℃下以13,000g离心15分钟后，将上清液转移到新管中。将提取溶液真空干燥并重悬于50％甲醇中。 同时，制备质量控制（QC）样品（所有样品的库）从一个红豆杉物种中混合等体积的每种提取样品。 在超高效液相色谱（UPLC）MS / MS分析之前，将所有样品储存在-80℃。

图1未定向的代谢物分析揭示了云南松和喜马拉雅红豆杉之间代谢物丰度的变化

a 喜马拉雅红豆杉枝条的图片。

b 喜马拉雅红豆杉（Jilong）和云南红豆杉（Motuo）的采集点分别用绿色和红色小点表示。

c 云南红豆杉枝条的图片。

d两种红豆杉物种代谢组中鉴定的代谢物热图（n = 15）。 热图比例范围从log4刻度的-4到 4.

针对非靶向代谢组学的UPLC-MS / MS分析

使用SCIEX UPLC系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）进行所有样品的色谱分离。 使用ACQUITY BEH Amide柱（2.1times;100mm，1.7mu;m粒径; Waters，Milford，MA，USA）进行反相分离。柱温箱保持在35℃，流速为0.4mL /分钟。 流动相由溶剂A（含有25mM乙酸铵和25mM NH 4 H 2 O的水溶液）和溶剂B（IPA：ACN = 9：1 0.1％甲酸）组成。 梯度洗脱步骤设定如下：0〜0.5分钟，95％溶剂A; 0.5〜9.5 min，溶剂A的95％~65％; 9.5〜10.5分钟，65％~40％溶剂A; 10.5〜12.0分钟，40％溶剂A; 12.0~12.2 min，40％~95％。溶剂A; 12.2~15.0分钟，95％溶剂A.每个样品的进样体积为4mu;L。

使用高分辨率串联质谱仪SCIEX Triple-TOF-5600 plus（Applied Biosystems）检测从柱中洗脱的代谢物。 Q-TOF在正离子和负离子模式下操作。帘式气体设定在30psi的压力下，离子源气体1和离子源气体2均设定在60psi，界面加热器温度设定为650°C。对于正离子模式和负离子模式，离子喷射电压分别设定在5000V和-4500V。质谱数据以信息相关采集（IDA）模式获得。 TOF质量范围为60至1,200Da。调查扫描是在150毫秒内获得的，如果超过每秒100个计数的阈值并且具有1 电荷状态，则收集多达12个产品离子扫描。总循环时间保持恒定在0.56秒。通过监测具有四阳极/通道检测的40GHz多通道时间 - 数字转换器（TDC）检测器，以脉冲器频率值11kHz对每次扫描求和四个时间段。动态排除设置为4秒。在采集期间，每20个样品校准质量准确度。此外，为了评估UPLC-MS / MS分析的系统稳定性，在每10个样品之后立即分析QC样品。

非靶向代谢组学数据集的生物信息学分析

使用XCMS软件进行获得的MS数据预处理，包括峰值挑选，峰值分组，保留时间校正，第二峰值分组以及同位素和加合物的注释。 LC-MS原始数据文件转换为mz.XML格式，然后由R软件实现的XCMS，CAMERA和metaX工具箱处理。通过保留时间（RT）和m / z数据鉴定每种离子。记录每个峰的强度，并产生包含任意指定的峰指数（保留时间-m / z对），样品名称（观察结果）和离子强度信息（变量）的三维矩阵。

在线KEGG，HMDB数据库用于通过将样本的精确分子量数据（m / z）与数据库中的数据进行匹配来注释代谢物。如果观察值与数据库值之间的质量差异小于10 ppm ，代谢物将被注释，代谢物的分子式将通过同位素分布测量进一步识别和验证。

此外，还使用内部片段的代谢物谱图谱来验证代谢物的鉴定。峰值数据的强度由内部软件metaX进一步预处理。去除了在少于50％的QC样本或80％的生物样本中检测到的那些特征，并且使用k-最近邻居算法估算具有缺失值的剩余峰值以进一步改善数据质量。使用预处理数据集对主体成分分析（PCA）进行离群检测和批次效应评估。基于质量控制的鲁棒LOESS信号校正相对于注入顺序拟合到QC数据，以最小化随时间的信号强度漂移。此外，在所有QC样品中计算代谢特征的相对标准偏差，然后除去gt; 30％的那些。

紫杉醇和黄酮类化合物的定量分析

分别从喜马拉雅红豆杉和云南红豆杉的六棵树中收获枝条。 样品彻底在40℃下干燥，然后研磨成粉末。 先前公布的方法的修改版本用于制备粗提取物[32]。 简而言之，使粉末通过过滤器（筛孔尺寸0.42mm），精确称量0.5g细粉末，并与15mL 100％甲醇混合。 将混合物在150W和40kHz下超声处理30分钟。在5000rpm离心5分钟后，收集上清液。 将残余物重新悬浮在15mL甲醇中并进行相同的提取步骤。离心后，将第二上清液与第一次提取物合并。 在UPLC-MS / MS分析之前，粗制的红豆杉提取物以1:10的比例稀释，所有样品通过0.22mu;m膜过滤器。

使用与SCIEX QTRAP 6500质谱仪（Applied Biosystems）偶联的LC-30 AD UPLC系统（Shimadzu，Japan）进行七种紫杉烷和八种类黄酮的定量。 MultiQuant软件（3.0版）用于数据采集和处理。

为了分离七种紫杉烷，UPLC在Kinetex C18柱（100times;4.6mm，2.6mu;m; Phenomenex，Torrance，CA，USA）上进行。流动相由65％溶剂A（甲醇）和35％溶剂B（含0.1％甲酸和2mM甲酸铵的水溶液）组成。流速设定为0.2mL / min。柱温箱保持在30℃，注射体积为5mu;L。毛细管温度设定为270℃，离子喷射电压设定为3.0kV。多重反应监测（MRM）用于正电离模式中的定量。转换m / z876.4→308.2,567.4→445.3,609.5→427.3,834.4→308.2,832.3→264.1,876.4→591.4和834.4→308.2分别用于定量PTX，10-DAB，BAC，DAP，CEP，7-E-PTX和7-E

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