珍稀树种的遗传衰退和近交衰退

Yuan-Yuan Li，Shen-Min Guan，Shu-Zhen Yang，Yuan Luo，Xiao-Yong Chen

摘要：许多濒危物种的种群规模很小，在某些极端情况下存活的个体还不到10只。虽然种群数量较少的后果已经引起了相当多的研究关注，但是很少有研究对极其稀有植物的命运进行研究。天目铁木就是只有5个自然再生的存活个体和少于150个人工再生的后代的一个物种。通过利用放大片段长度多态性(AFLPs)，我们发现在5个野生个体中，多态位点的比例较低，但有中度杂合性。在后代中观察到了遗传多样性的严重下降，与亲本世代相比，杂合度降低了36.7%，每个个体扩增的标记数量减少了12%，这是由遗传漂变和近亲繁殖引起的。有效种群数估计为1。亲本遗传差异与存活后代数量之间存在显著正相关关系，说明近交系抑郁可能清除了更多近交系后代。提出了保护和恢复极端珍稀植物（例如天目铁木）遗传变异的意义。

关键词：遗传多样性；近交衰退；瓶颈；亲子关系分析；AFLPs；濒危物种；天目铁木

介绍

由于自然或人为干扰，许多物种可能会遇到严重的人口瓶颈（Lu et al 2006）。在极端情况下，整个分销范围内只剩下一个或几个人。例如，中国有12个植物物种，在该领域只有一到十个自然更新的存活个体（Gu 2003）。这些物种正处于灭绝的边缘。然而，对这些极为稀有的植物却没有给予足够的重视，尽管在过去几十年中人口规模小的后果已经引起了相当多的研究注意（Ouborg et al。2006）。

在小群体中，遗传漂变和近亲繁殖可以在遗传变异和持久性方面发挥重要作用。遗传漂变和近亲繁殖将减少群内遗传多样性，这是小群体持续存在的潜在威胁（Willi et al.2006）。与近亲交配后代相比，近交抑制对近交后代的适应性下降，这对于受威胁的物种尤为重要（Frankham，2005），因为这些物种的种群规模较小，因此近交是不可避免的（Leimu et al.2006；Reed 2005）。然而，在野外条件下，长寿命的树木几乎没有发现近亲繁殖的后果，部分原因是由于难以追踪双亲近亲繁殖后代的命运。高度多态的分子标记，如扩增的片段长度多态性（AFLPs）和微卫星，已被证明是有效的鉴定该领域的个体幸存者的亲本（Ahmed et al。2009）。当一些假设（例如，亲本个体交配的机会相等）存活的子代中的每个交配对的后代可以作为后代适应性的指标，因此可以在田间推断亲代亲缘关系和后代适合度之间的关系。

濒危植物天目铁木春（2n = 16）（桦木科）（Meng et al。2004）是中国特有的一种极为稀有、濒临灭绝的落叶乔木，只剩下5只天然产生的个体。1927年第一次记录的时候，天目铁木在浙江省天木山的一片开阔的树林中很常见。其种群规模的迅速减少很可能是由于森林砍伐和竹子的种植造成的。天目铁木是风媒传粉的，一般而言，具有丰富但很轻的种子，其生活力较差。由于有限的自然补充，种子已经在普通的园林中被收集和发芽，并且自从20世纪80年代以来，大约有1000株苗被移植到田间或者分配到了植物园（Guan and Tao 1988; Zhang et al.1988）。 然而，在2008年的调查中，我们发现在田间和园林中存活的个体不到150株，这表明这种树的死亡率很高。在这项研究中，我们评估了天目铁木的遗传多样性和确定幸存的后代与下面的亲子关系的目标：（1）比较自然再生个体与其后代的遗传差异；（2）测试配偶之间的遗传相关性是否影响后代在该领域的存活；（3）提出保护极端珍稀植物的一些建议，如天目铁木。

材料和方法

样品采集

现存的5个自然再生天目铁木和大部分后代都位于中国浙江省西北部的天目山。在现存的5个野生个体中，最大的个体树干直径(DBH)约为0.9 m ，估计超过200岁。另外四个亲本个体树干直径约0.6 m，估计超过100岁。这些树被认为是以前的大量种群的残余。在天目山，大部分后代高度在10米以上，树干直径在0.15米左右，处于早熟阶段。 这些树木已经从五个成熟的个体收集的种子在共同的花园中萌发，并且在1或2年的生长后移植到田地中。对五个自然再生个体及其128个后代个体进行采样。 从每个个体取出健康的叶子，并用50g硅胶在密封袋中干燥。

DNA提取和基因分型

用改良的CTAB法从干叶中提取总DNA（Fan等，2004）。 首先，我们试图发展微卫星分析天目铁木的遗传结构。 然而，我们没有获得多态性简单序列重复（SSR）标记，因此，我们使用AFLP标记。使用6对引物（E-AAG / M-CAC，E-ACT / M-CAG，E-ACC / M-CAG，E-AAG / M-CTA，E-ACA / M-CAA和E- ACT / M-CAT）用荧光标记的引物进行检测。 在ABI Prism 377 DNA自动测序仪（美国应用生物系统公司，福斯特城，CA，美国）上解析DNA图谱。使用GeneMapper 4.0软件（应用生物系统公司，福斯特城，CA，美国），我们对AFLP图谱评估存在或不存在长度在70和500bp之间的片段。

数据分析

遗传变异是在亲代和后代中通过使用标记的总数，以及多态标记的数量和比例来确定的。期望杂合度计算使用方程HE =2pq和所有位点的平均值，其中q通过贝叶斯估计（方程15，Zhivotovsky 1999）测量。以前的研究发现桦木科植物通常是异交的（Xie et al。2002），FIS接近于0。然而，目前天目铁木的种群规模非常小，可能发生了一些双亲的近亲繁殖。由于将FIS值设置为0到0.5，得到了相似的值，在等位基因频率的估计中固定指数为0.3。用t检验，假设方差不均（R开发核心团队2008），对双亲和后代的杂合度进行了检验。为了比较父母和子代之间带的数量差异，我们测试了从子代池中随机重新取样的5个亲本个体和5个后代之间的差异，并且使用R（R开发 核心团队2008）进行了1000次重新采样。

我们使用Krauss等人（2002）描述的方法估计有效种群大小（Ne）：Ne=H₀/2(H₀-H₁)，其中H₀和H₁分别是亲代和子代代平均杂合度的贝叶斯估计。尽管AFLPs在亲本研究中的效率低于共显性微卫星，但信息的损失可以通过大量的多态性位点来抵消（Gerber et al.2000; Wang 和 Santure 2009）。在本研究中，每个后代的亲本使用遗传排斥分析手动分配，排除概率使用FaMoz软件（Gerber et al.2003）计算。当获得非单一的亲子关系时，使用COLONY v.2.0.1.1软件（Jones and Wang 2010），使用全谱家系可能性方法（Wang和Santure2009）将后代分配给潜在家系。我们用一个近亲繁殖模型定义了一夫多妻交配系统。 等位基因丢失率为0，标记基因分型误差为0.01％。 该程序根据当前样本估计等位基因频率。

我们构建了一个相似矩阵的相似性对使用Jaccard系数样本（Keil和格里芬1994）。这个值被转换成相差的度量（D），其中D=1-S。计算父母，后代，半同胞和全同胞之间所有成对个体之间的平均相似性（在亲子作业之后）。为了推断近亲型抑郁症的潜在影响，我们使用方差分析（ANOVA）（R Development Core Team 2008）检查了父母不相似性与其后代之间的关系，并测试了它们的显着性。

结果

表格 1由6个扩增的片段长度多态性引物对在天目铁木中的亲代和子代产生的遗传统计。

N个个体，Nb带数，Npb多态性条带数，Nb-ind平均每个个体的带数，PPB多态性带百分比，通过贝叶斯方法估计的HE期望杂合性（参见正文），D之间的平均遗传相异性 所有的个体对，SEM的平均标准误差

六个AFLP引物对在亲代中共产生204条带。 与亲代相比，后代中每个个体扩增的标记数量减少了12％（表1）。后代只有一条谱带缺失。双亲和后代个体多态性条带百分率分别为29.9和40.4%（表1）。然而，双亲代平均带数为181，显著高于子代（159.3）（P＜0.001）。亲本代数的贝叶斯估计杂合度为0.406，也显着高于后代（0.257）（t检验，P lt;0.001）。

使用遗传排除方法，对128个后代中的40个鉴定了唯一的亲本对。 单亲父母的排除概率为0.94273，父母的排除概率为0.99237。 结合可能性方法，共有93个后代被分配给潜在的父母对。除了一个个体外，所有后代都是异交的。 在15种可能的亲本组合中，亲本由两种组合P1times;P3和P2times;P5主要分别具有37和28个后代。遗传差异与配子后代数量呈显着正相关（图1）（P lt;0.05）。

后代（0.136）的平均遗传差异（d）较小，但不显著大于亲本（0.145）（表1）。然而，全同胞遗传相似性（0.134）比半同胞明显缩小（0.150）（P 0.001）。根据亲本（0.406）和后代（0.257）的杂合度估计，有效群体大小估计为1。

图 1一对亲本的遗传差异与天目铁木中存活子代的数量关系

讨论

正如所料，五个现存的自然再生个体中极少见的树种天目铁木发现了低水平的遗传多样性。多态位点的百分比(29.9%)低于其他极为罕见的植物，如:Metrosideros bartlettii (44%) (Drummond et al. 2000)和Grevilla scapigera (75.5%) (Krauss et al. 2002)，但高于极罕见的Metrosideros boninensis (12.9%) (Kaneko et al. 2008)。然而，期望杂合度（HE＝0.406）高于上述三种。相对高的杂合性暗示的人没有经历了一个长期的瓶颈，为杂合性降低等位基因数目更慢（卢卡特和cornuet 1998）。这一结论也得到了先前记录的数据的支持。当这一物种首次报道，它被发现相当普遍在开放的森林（春1927），和现存的亲本个体是以前大量的种群残存下来的，由他们的年龄决定。因此，低遗传变异是个体丧失的直接结果，遗传漂变在亲本个体的遗传组成中不起主要作用。

尽管亲代个体的遗传变异水平较低，但我们发现后代的遗传变异显著下降。与父母水平相比，后代的杂合性下降了36.7%(表1)。Krauss等人 （2002）发现濒危植物Grevillea scapigera的易位种群迅速下降。 遗传变异的这种下降是由于遗传漂变和双亲近亲繁殖（对Nei等人，1975）（如本研究中的Ne = 1）的影响最大的因素。近亲繁殖也得益于后代中每个个体的条带数量的显着减少，这最可能是由父母本中杂合基因座的隐性等位基因的同质性引起的。 此外，天目铁木的后代平均比它们的亲本（表1）高出6.2％，这是双亲近亲繁殖的一个常见后果（Chen et al.2003）。先前的研究表明，桦木科的种类主要是异交的（Xie et al。2002），自交的植物与异交的家族相比，近交衰退已被观察到（Wang et al。1999）。在这项研究中，唯一的幸存者是自交的后代的亲子关系的分析显示，这表明天目铁木存在异交。双亲遗传差异与存活后代数量之间存在显著的正相关关系，表明近交衰退可能在后代存活中起着重要作用。近交后代在生命周期的任何一个阶段，如种子生产，发芽，幼苗生长阶段等都不会存活下来，而适应度相对较高的异交子代存活率较高。在其他植物中也观察到亲本的遗传相关性和后代适合性之间的这种正相关关系（Hirao 2010; Seltmann等2009; Wagenius等2010）。 我们的结果是从显性标记中推断出来的，这些标记在同胞和亲子关系中比微卫星具有更低的能力（Gerber et al.2000）。然而，大量的多态位点(Gerber et al. 2000)可以抵消信息的丢失，如本研究中所发现的。

保护的意义

很明显，这五个人自然再生天目铁木有很高的优先保护，而他们的后代也需要保护。在这个领域，天目铁木死亡的主要原因是人为干扰和其他树木或竹子的竞争。因此，需要围绕这些成熟的个体避免直接的干扰。在含有成熟的个体及其后代的栖息地中，也可以考虑切割与天目铁木竞争光照的竹子和树木，这种考虑对于幼苗和抽样

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