PINK1功能的丧失影响神经退行性疾病的斑马鱼的发展和成果

奥列格Anichtchik，海克Diekmann，Angeleen Fleming，艾伦Roach，保罗Goldsmith，和David C. Rubinsztein

峰会上，Waterbeach，剑桥CB259TN，英国，神经内科，Addenbrooke医院，剑桥CB22QQ，英国，医学遗传学，剑桥大学医学研究所，Addenbrooke医院，剑桥CB22XY，英国

帕金森氏病（PD）是在西方世界第二最常见的神经变性疾病。 PTEN（第10号染色体磷酸/张力蛋白同系物）诱导推定的激酶1（PINK1），该被突变了PD的常染色体隐性形式的推定的激酶，也与该疾病的散发病例。虽然突变似乎导致功能丧失，这种蛋白质和参与PINK1 PD的作用的途径是知之甚少。在这里，我们产生PINK1不全的脊椎动物模型使用吗啉代寡核苷酸击倒在斑马鱼（斑马鱼）。 PINK1拦截结果在由野生型人PINK1的mRNA救出一个严重的发育表型。 Morphants显示中度降低在中枢多巴胺能神经元和线粒体功能的变化，其中包括增加caspase-3的活性和反应性氧物质（ROS）水平的数目。当morphants暴露于几种药物，具有抗氧化性能，ROS水平进行标准化和相关的表型的改善。此外，GSK3beta;相关的机制可以解释一些PINK1击倒的效果，作为morphant鱼显示升高GSK3beta;活性和它们的表型是由GSK3beta;抑制剂，如氯化锂和SB216763部分废除[3-（2,4-二氯苯基） -4-（1-甲基-1H-吲哚-3-基）-1H-吡咯-2,5-二酮]。这提供了新的见解PINK1的生物学和可能的治疗途径进一步调查。

关键词：帕金森氏病；斑马鱼；神经退行性疾病；线粒；ROS；PINK1

介绍

帕金森氏病（PD）是在西方世界第二最常见的神经变性疾病。迄今为止六种基因与致病突变已被确定为有助于PD的孟德尔形式。这些包括两个常染色体显性基因，alpha;突触核蛋白（SNCA）和富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2），和三个常染色体隐性基因，帕金，DJ-1，和磷酸/ 10号染色体上（PTEN）张力蛋白同系物诱发的推定激酶1（PINK1）（Valente的等人，2004; Klein和Schlossmacher，2006）。在第六基因的明显显性突变，泛素C末端水解酶L1（UCHL1），只被发现在一个小型的家庭和家族性PD相关性仍有争议（希利等人，2006年）。 PINK1突变是常染色体隐性遗传的PD帕金（Li等，2005）之后的第二最常见的原因，并且PINK1也牵连在疾病的散发病例（Valente的等人，2004）。 PINK1]是广泛表达在人的大脑，并通过N端序靶向定位于线粒体膜高度保守的581个氨基酸的蛋白（甘地等人，2006）。这股同源性钙调蛋白依赖性蛋白激酶1，包含一个催化丝氨酸 - 苏氨酸激酶结构域，并且具有在体外磷酸化活性（辛等人，2006）。 PD-引起突变似乎导致功能丧失（辛等人，2006）。

PINK1果蝇的最近的研究表明其对线粒体功能的重要性。丧失功能的PINK1展览雄性不育，肌肉和多巴胺能神经元变性，并提高了灵敏度的突变体，以压力（Clark等人，2006; Park等人，2006; Yang等人，2006）。 PINK1突变果蝇具有降低帕金的表达，并具有表型类似，苍蝇帕金功能的丧失。因为帕金的过表达拯救引起PINK1不足的表型，而不是相反，已经提出，帕金PINK1的下游作用，也表明理解PINK1功能可能是相关引起的任一或帕金PINK1突变的PD。 PINK1激酶活性的分子靶点被研究甚少。最近，线粒体分子伴侣TRAP1的磷酸化是由于PINK1（Pridgeon等，2007，），进一步加强PINK1的线粒体相关性。

材料和方法

斑马鱼应变畜牧业和原位杂交

在AB株野生型斑马鱼是在符合动物福利立法保持在28.5℃的标准条件下（韦斯特，2000年）。胚胎收集自然产卵后，上演如前所述（金梅尔等人，1995），和在胚胎培养基（韦斯特，2000）提出的。原位杂交全安装了如前（乔伊特和丽红，1994年）完成的。使用的PINK1，帕金，颤的cDNA产生的反义地高辛标记的RNA探针（Costagli等人，2002），菲斯（莱夫科维茨等人，2003），和神经元素-1（NGN-1）（Blader等人， 1997年）。所有的畜牧业和实验程序按照动物（科学程序）法进行。

在斑马鱼PINK1同源基因硅片鉴定

为了识别斑马鱼PINK1直向同源物，一个基本的局部比对搜索工具（BLAST）搜索ENSEMBL斑马鱼基因数据库（http://www.ensembl.org/Danio_rerio/index.html）使用人PINK1氨基酸序列进行（ ENSG00000158828）。基于所获得的序列，设计引物以扩增斑马鱼基因的完整序列。 mRNA的分离自不同年龄的胚胎，逆转录与第一链合成试剂盒（Invitrogen）中。 PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析。

吗啉和mRNA注射和药物治疗

吗啉代寡核苷酸（MOS）（ATG定位，5-GCT GAG AAC ATG CTT TAC TGA CAT T-3; 5非翻译区（UTR）定位，5-ATA TTG ACT ATG AGA GGA AAT CTG A-3 ; ATG靶向五错配控制，5- GCT CAC AAC ATC CTT TAG TGA GAT T-3; 5-UTR靶向五错配控制，5-ATA TTC AGT ATC AGA GCA AAT GTG A-3 ）靶向要么在ATG或斑马鱼PINK1基因的5-UTR区是从基因获得的工具，并溶解在1times;Danieau培养基[含有（单位mm）58氯化钠，氯化钾0.7，硫酸镁0.4，0.6的Ca（NO 3），2.5 HEPES，pH值7.6。单细胞阶段的胚胎注射ATG和5-UTR吗啉的组合在7,9，和13纳克每。五错配对照吗啉代用于测定注射吗啉的浓度下产生的来自吗啉毒性截然不同的表型。额外的控制来监视注射技术的质量包括一个标准的控制啉（5-CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A-3），其靶向剪接位点在人beta;珠蛋白基因（阴性对照的注射），且靶向斑马鱼脊索基因（5-ATC CAC AGC AGC CCC TCC ATC ATC C-3）（阳性对照）（均来自基因工具一吗啉代）。

合成的cDNA从克隆至pcDNA / V5-DEST封端的mRNA，编码用T7 mMessage mMachine试剂盒（Ambion）人全长野生型PINK1基因。对应于临床相关突变位点A168P和W347X被使用的QuikChange II XL定点诱变试剂盒（Stratagene）中改变。六十五皮克表达均具有PINK1的MO一起注射到胚胎单细胞阶段。

对于药理救援实验，氯化锂（0.5-50毫米; Sigma-Aldrich公司），3-（2,4-二氯苯基）-4-（1-甲基-1H-吲哚-3-基）-1H-吡咯-2,5- - 二酮（SB216763 1-10微米; Tocris Bioscience公司），还原的谷胱甘肽（GSH; 100微米）和N-乙酰基半胱氨酸（NAC; 100微米）溶解在DMSO或水和被引入胚胎媒体6小时后啉注射DMSO的最终浓度是在水中的0.2％。鱼进行分析注射后24小时和48小时。

为了抢救结果量化，数据是从15-20胚胎在每个阶段和年龄云集。的正常表型表示为100％，且变化的形态进行评分，并相应地计算。由至少三次实验的数据合并为统计分析。

我们用五错配控制MOS作为本研究中的“控制状态”，除非另有说明。一般情况下，五错配对照MO的使用并没有产生从幼稚鱼不同的任何表型的浓度。

免疫组化和PAGE

免疫组织化学对微管蛋白乙酰化的（Sigma-Aldrich公司），酪氨酸羟化酶，血清素（5-HT）（Immunostar），和PINK1（曼化学公司）进行如先前所述（Kaslin和Panula，2001）。使用装有数码相机奥林巴斯SZX12或BX51荧光显微镜图像拍摄，并使用AnalySISD 5.0​​软件（软成像系统）处理。亮度或对比度没有调整，图像采集后进行。对于Western印迹法，的24-48小时受精后（HPF）胚胎dechorionated，yolked（Link等人，2006），匀浆放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液用蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并处理用于SDS-PAGE。进行检测与ECL试剂（GE医疗集团生命科学）和化学发光信号是可视化的暴露膜ECL使用Hyperfilm（GE医疗集团生命科学）免疫反应带。电影是用台式扫描仪HP ScanJet扫描3800扫描，并使用ImageJ软件（国立卫生研究院）进行了印迹的密度分析。该薄膜的背景强度中减去从带强度。至少三个独立的实验进行了分析，并带强度进行标准化的加载对照带强度。酪氨酸羟化酶（TH） - 阳性神经元的定量是在24和48高倍视野整体式安装完成，deyolked，扁平式的胚胎用40times;物镜计数所有的荧光细胞体在大脑中。在控制五错配MO-注射的胚胎神经元的数目是作为100％，且变化PINK1 MO组中被相应地进行计算。每个实验从至少四个实验汇集为统计分析进行分析至少七个胚胎每组，和数据。

检测细胞死亡

通过活24-孵育被检测到48-HPF-大的胚胎在吖啶橙溶液凋亡/坏死细胞（5微克/毫升）（古谷精机等人，1996）。细胞装有染料用在奥林巴斯SZX12荧光显微镜一个四甲基异硫氰酸酯滤波器可视化。为了检测胱天蛋白酶-3的活性在斑马鱼胚胎，鱼人匀浆在冰冷RIPA缓冲液，并在匀浆用的0.39毫米乙酰天冬氨酸-GLU-VAL-天冬氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素等体积（混合西格玛-Aldrich），有选择性的caspase-3底物，产生荧光的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的释放。使用Victor3酶标仪（珀金埃尔默生命和分析科学）进行检测的AMC（360和460nm处，分别地）的激发和发射波长。将反应物​​归一化的总蛋白浓度。胚胎治疗紫外光（400mu;J/ cm2时，0.1秒），6小时的试验担任凋亡诱导的caspase-3的活化阳性对照之前。孵育100微米泛胱天蛋白酶-3抑制剂苄氧羰基缬氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸（OME）-fluoromethylketone（ZVAD; R＆D系统）用作阴性对照。

活性氧（ROS）的积累，通过细胞穿透物的ROS指示剂乙酰酯的氧化形式的电平评估5-（和6-）氯-2，7-二氯二乙酸酯（CM-H2DCFDA）（Invitrogen公司），在活鱼检测如下。注射的胚胎被dechorionated，几组三个胚胎的放入96孔板的孔中，并用火抛光的玻璃巴斯德吸管除去过量的培养基。胚胎培养中1mu;g/ ml的CM-H2DCFDA长达2小时，并测定荧光用Victor3酶标仪（珀金埃尔默生命和分析科学）（激发波长485nm，发射560纳米）后，每10分钟。的CM-H2DCFDA的自发氧化在孔中没有鱼被监视，并且该水平低和随时间没有改变。 H2O2溶液作为阳性对照。

分离线粒体

粗线粒体和细胞质级分使用Mitoiso 1分离试剂盒（Sigma-Aldrich公司）分离。简言之，将胚胎80-100 24高倍视野进行收集，dechorionated，匀浆在所提供的提取缓冲液（10毫米HEPES缓冲液，pH为7.5，含有200毫米甘露醇，70毫米蔗糖，1毫米EGTA和2毫克/毫升BSA）中。匀浆纺丝600times;克在4℃，并且上清液然后纺11000times;g下在4℃10分钟。上清液，代表胞质级分，取出并储存在冰上。沉淀再悬浮于提取缓冲液，并重复进行离心。将所得沉淀再悬浮于储存缓冲器[10毫米的HEPES缓冲液，pH 7.5，含有（单位mm）250蔗糖，1 ATP，0.08 ADP，5琥珀酸钠，2 K 2 HPO 4，和1 DTT〕，以及使用该蛋白质浓度测定Bradford方法。 5,5，6,6- Tetracloro-1,1，3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine碘化物（JC-1）的摄取，线粒体Delta;psi;膜电位指示剂，然后通过培养由蛋白水平调整评估。所述制备物孵育在黑暗中10分钟，并使用Victor3酶标仪（珀金埃尔默生命和分析科学）（激发，490纳米;发射，525和590毫微米）检测荧光。的五百三十○分之五百九纳米比（橙/绿）被认为是线粒体Delta;psi;膜电位的指标。孵育1微克/毫升缬氨霉素导致减少JC-1橙/绿荧光，并用作阳性对照。所得制剂的纯度进行评价，用肌动蛋白作为胞质的控制，和孔蛋白作为线粒体样对照（补充图1中，可在www.jneurosci.org作为补充材料）。

统计

汇集估计的变化尾的表型，从扰动在多个实验评估所得，计算为比值的95％置信区间的比率。我们经常使用这种方法，在过去，以允许从多个独立的实验数据的分析（Wyttenbach经营等人，2001，2002;卡迈克尔等人，2002）。赔率比率和P值被无条件后勤回归分析确定，使用SPSS9软件一般对数线性分析选项。在其他实验中，双向ANOVA和t检验（的GraphPad棱镜4）中使用时，适用的。

结果

斑马鱼PINK1鉴定

在这里，我们抑制了PINK1翻译在斑马鱼有MOS审查其在脊椎动物发展中的作用。要确定斑马鱼的基因，我们进行BLAST与

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