利用EST-SSR标记研究麦冬及麦冬属的遗传多样性

摘要

利用通过在麦冬cDNA文库的545个ESTs开发分析出的202个位点进行进一步的遗传分析麦冬及沿阶草属品种，评估遗传多样性和68份麦冬及沿阶草属种质资源（Liriope platyphylla, Liriope spicata, O. japonicus,and Ophiopogon jaburan）。22个SSR位点中，二核苷酸序是最常见的，占56%，AG / GA是最常见的二碱基重复序列，占42%。多态性分析显示，遗传背景较宽，平均遗传多样性指数0.46。基于模型的STRUCTURE结构分析，揭示了存在的三个亚群，基于遗传距离的聚类分析基本一致。这些新开发的EST-SSR标记将进行进一步的研究，如分类使用，分子育种的研究，将进一步提高我们对生命科学群体遗传学的理解，以及保护良好麦冬种质资源的留传。

关键字：麦冬 沿阶草属 EST-SSR 识别 遗传多样性 种群结构

1.背景简介

麦冬类植物是指百合科山麦冬属（Liriope Lour）和沿阶草属（Ophiopogon Ker-gawl），一般广泛分布于亚热带和温带地区，如中国，韩国，日本和印度。百合科山麦冬属包括约八个物种，沿阶草属包括约54个物种。这两个属关系密切，生长地极其相似（戴和梁，1991）。在麦冬块根甾苷（王等，2011）是广泛用于治疗许多疾病，如心肌缺血、血栓形成、缺氧、衰老，并减少糖血症（Kako等，1995）。此外，麦冬门（麦冬、沿阶草属）表现出强烈的抵抗环境污染的能力，并且已经成为重要的园林地被植物，具有很高的经济效益，因此，麦冬具备相当的商业应用潜力。尽管他的园艺和药用价值很高，但是由于麦冬数量有限的分子标记及其小的多态性信息，导致麦冬的分子研究落后于其他物种。传统上，麦冬分类主要基于形态学数据，通过花、叶和根系特征，产生了各种各样的分类系统。由于麦冬品种难以区分，导致正确命名混乱，市场出现正品被替代，品种贴错标签，幼苗入侵品栽培品种体系，导致品种退化。

分子研究对确认物种和品种形态学描述提供了一个很大的进步空间，但迄今为止，只有少数基因组标记已被探索。许多研究试图使用不同的分子标记区分麦冬以分类，如随机扩增多态性DNA（黄等.，2009）。目标区域扩增多态性（张和陈，2010），ISSR（刘等，2010），Yamashita和Tamura (2001) 研究表明，麦冬和沿阶草这对姐妹植物之间的关系基于叶绿体DNA序列数据，这些标志物的研究阐明了在麦冬属和沿阶草属这些各种各样的品种间的亲缘关系和遗传多样性，但关系仍不清楚。因此，有必要开发一个大量分子标记和一个正确的植物识别系统去准确地识别这些植物。

与其它类型的分子标记相比，简单重复序列（SSR）标记由于它的共显性遗传，位点丰富、多等位基因的性质，广泛的基因组覆盖，以及易于检测的聚合酶链反应（聚合酶链反应），已经成为最重要的分子标记之一。此外，微卫星是最成功和最强大的PCR基因标记，广泛应用于个体鉴别和亲属检测、种群遗传学（Park 等，2009）及有限数量样本的分析或降解样本的分析（MOE 等，2010）。然而，广泛使用SSR标记时，往往受到时间以及参与成本的限制，因此就有必要构建DNA文库，测序，鉴定识别含有SSR的克隆和SSR转移，这限用于有亲缘关系的物种（Ma 等，2009；peakall 等，1998）。从表达序列来看，通过使用先进的标记，转移标记的数量有可能提高。（kuleung 等.，2004）。

表达序列标签（EST）的研究已经产生了大量的公开可用的序列数据，研究数据来自许多物种植物，这些数据可以被开采并用于简单重复序列（SSR）（Pashley 等.，2006）。EST-SSRs不同于传统的SSR（基因组SSR）标记，在这些SSR标记直接关联的转录基因组内存在一些内在优势，超越了传统SSR标记，如开发费用低，以及相关物种可转移性高（Mian 等, 2005）。多态性源于ETS-SSRs是与基因组编码区以及遗传多样性或者邻近基因相关的，可以提供有用的交叉育种信息（Varshney 等., 2005）。事实上，要既快速又经济的从EST数据库开发SSRs从而获得高质量的核标记是可行的(Gutierrez 等, 2005)。随着EST序列的大量增加，越来越多的EST-SSR标记已经被确定识别，并且广泛应用于比较基因组，DNA指纹识别、遗传多样性和可转移性，如柑橘属（Luro等.，2008），莴苣属（RIAR 等，2011），蓖麻子（Qiu 等，2010），和大麦属（Thiel 等.，2003）的鉴别。

有效的保护和管理山麦冬需要我们去了解他们的基因结构。据我们所知，目前没有研究报道麦冬EST-SSR标记的开发。现在我们的目的是从GenBank的EST数据库去开发麦冬EST-SSRs标记，然后评估四种麦冬中的遗传多样性和遗传结构（阔叶山麦冬、山麦冬、沿阶草属麦冬，麦冬），相信这将更有助于我们了解和管理麦冬。

2．材料和方法

2.1 植物材料和DNA提取

采集的68份麦冬类植物分为4种，两种山麦冬种质（编号67、68号）收集于中国四川、浙江地区，其他材料都来自国家园艺与植物科学研究所、农村发展管理局（RDA）。分成五份，对第一份1号（L. platyphylla），18号（山麦冬）、23号（麦冬）、38号（麦冬）和62号（O. jaburan）进行PCR，检测麦冬标记的适用性。用于以至少有五个重复核苷酸序列、四个三联体以及四个核苷酸SSRs为标准搜索SSR标记。

从鲜叶用DNA提取试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取DNA。相对纯度和所提取的DNA浓度与NanoDrop nd-1000相近（NanoDrop技术，Inc.，威尔明顿，DE，美国）。最后将每一个DNA样本的浓度调整为20毫微克/毫升。

2.2 SSR数据采集和引物设计

EST序列是在利用ENTREZ搜索工具搜索EST数据库获得的。这项研究总共从两个cDNA文库中获得545个可用的ETS序列。在这个初步的步骤中,获得的EST序列不到100bp ，排除低质量的序列( 泰尔等 .,2003)。一个网络搜索工具具,SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool). 用于以至少有五个重复核苷酸序列、四个三联体以及四个核苷酸SSRs为标准搜索SSR标记。

引物设计使用Primer 3 software (Rozen and Skaletsky, 2000)。主要设计参数：引物长度范围从18bp到28bp,以20bp为最佳,PCR产品尺寸范围从100bp到400bp,退火温度50 ℃-60 ℃，G-C 含量从40%提高到70%,以50%为最佳。

2.3 SSR扩增和PCR产物分析

3引物系统(Schuelke,2000)为一般以6-FAM荧光染料、NED、VIC、或者PET其中之一为标记的M13寡核苷酸(5-TGTAAAAC-GACGGCCAGT-3)。因此,进行PCR反应有三对引物;其中一对引物的微卫星引物对，它尾部通附加了通用M13在其5端。第二对引物是一个正常的基因座特定反向引物,第三个引物是有荧光标记M13。

利用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的5rsquo;或3rsquo;端加上2-4个随机核苷酸，锚定引物引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。

PCR扩增体系为20ul，包括50 ng基因组模板DNA，1times;PCR buffer 0.2ul, dNTPs 0.2 mmol/L, 1U Taq 酶，8 pmol每个反向fl荧光标记的M13引物，多重PCR扩增体系内各位点上、下游引物分别为0.2umol/L。

PCR体系：94℃预变性53min，接着，30个循环（94℃变性30s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s），然后，10 个循环（94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s），最后，72℃延伸5 min，4℃保存。

样品在PCR扩增仪3500转自动化运行（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）。用GeneMapper 4.1软件分析（Applied Biosystems）扩增结果。

表1

2.4 数据统计

在等位基因的数量方面每个位点的变化测量,主要的等位基因频率、基因杂合性

多样性和多态信息含量(PIC)。对每一组数量性状数据进行分析，取平均值。对于取得的质量性状和数量性状的区间数据进行标准化转化，以尽可能减少由于各种形态性状的测量尺度不同对结果造成的影响。样本间的距离采用欧氏距离（Euelideandistanee Coefficient）（Labra et al.，2004）,并且在软件MEGA4（(Tamura l., 2007）利用类平均方法（UPGMA）进行组合聚类分析。

3． 结果

3.1 麦冬的SSRs分布和频率

所有的EST，308份麦冬5mRNA序列源自治疗麦冬（LF）kergawl cDNA文库已由徐（未出版）提交，而237例由汉（未出版）提交。聚类分析和收集ESTs序列后,531号EST序列被用来寻找SSRs,体现463.94 kb。随着SSRIT方案筛选SSR标记，使73SSR-ESTs含89个SSR ESTs分离。表明这13.75%个序列包含SSR，给出每一个SSR的平均频率为5.21 KB或每一个SSR 7.27ESTs，在分析麦冬cDNA文库。SSR标记的89个，12号（13.5%）含多个SSR。SSRS的平均长度为18 bp（表2）。

3.2 ETS-SSR标记的多态性可跨属转移性

在这些EST-SSRs，74号用于设计引物；其余15个由于 flanking egions太短或者引物设计标准不适合等原因而无法使用。选定五份分别来自麦冬类植物的进行扩增反应，并测试74号引物的通用性。在这些引物中，使用67号引物（90.5%）进行扩增，但只有22（32.8%）EST-SSRs多态性与预期大小相符在68份麦冬类植物中，22个ETS-SSR标志，为每个 EST-SSR标志命名,确定其正向和反向引物序列,重复,退火温度,以及预期大小的PCR产物如表4所示。在洛杉矶用白桦和山麦冬的检测67对引物扩增反应时使用相同的PCR条件，结果表明，七对引物进行了扩增反应，我们用67对引物使用更好的扩增系统作进一步研究，但只有收集到22（32.8%）多态性位点。EST-SSR标记已被报道一般显示较低的多态性从基因组文库中（Gupta和Rustgi，2004）。

表2

EST-SSRs一般功能分类如表4所示。基于BLASTX分析22 个SSR-ESTs反对NCBI冗余序列数据库,这些多态的结果表明,七个EST序列匹配基因参与细胞运输和其他生物过程,以及15是未知的或假想的蛋白质。

3.3 68份种质遗传多样性和种群结构的评价

为了评估这些新开发的EST-SSR有用性的研究,在中国和韩国收集了68份遗传变异，使用PowerMarker V3.25生成遗传距离矩阵，使用MEGA 4软件构建UPGMA树。麦冬上共标记了68个多态性等位基因。每个SSR等位基因的数目从两个到五个不等，平均为3.09个。基因多样性标记有很大的变化，从0.10（ls008）到0.66（ls011），平均为0.46。杂合度和多态信息量（PIC）值分别为1、0.56和0.09，平均值分别为0.59和0.38（表0.03）。表5为中国和韩国麦冬遗传多样性的比较图。22号EST-SSRs发现麦冬属麦冬有67个等位基因，每个位点平均有3.05个等位基因，而沿阶草属麦冬含有51个等位基因，平均每个位点有2.32个等位基因。平均遗传多样性（0.49）、期望杂合度（0.69），和PIC（0.39）均高于对麦冬（分别为0.44，0.55，0.36），这表明麦冬有较高水平的遗传变异比麦冬。每个SSR位点的平均遗传多样性和照片也被用来评估朝鲜和中国的品种，分别为0.46、0.27、0.38、0.20（表5）。

不同品种相似系数有效值在的范围从0.0400到0.5882与，平均值为0.2340（图1）。在UPGMA系统中将68份种质资源分为两组。其中一组包括62份，进一步分为两个亚组，G 1-1，包括从L. platyphylla 54份，两份 L. spicata（编号52、53），和一份 O. japonicus（编号37）和G 1-2组成（都属于山麦冬）。第二组包括六种种类，进一步分为两个亚组：G2- 1包括两种O. japonicus （编号60，62）；三种O.japonicus（编号22，39，56），和一O. jaburan（61号）形成G 2-2。分组可区别使用在22 EST-SSRs标记中选择分别对应的标记，除了编号32（L. platyphylla）和编号34（L. platyphylla）。进化树显示收集来自中国的编号67、68这两个关系密切。利用基于模型的聚类分析方法对所有68个麦冬种质进行了遗传结构分析。

运行五次STRUCTURE进行人口数（钾）从2到10的设置。对于一个给定的k我们使用了专案数量（DK）来估计似然值，如果L的分布（k）未能显示模式为真正的英国DK的开发，针对K状态下解释不同水平，从哈代–温伯格均衡的近亲繁殖和分离因素，目前是一个真正的不同的模拟人口结构程序下测试的（falush et al.，2003）。对68份麦冬DK值最高的是Kfrac14;3（图2）。在Kfrac14;3，68份材料分为三个簇，基于遗传距离的聚类（图1）。75%以上的个体其基因组分数的值分配为一组。alpha;参数相对较小（一个frac14;0.0382），显示大部分品种起源于一个祖先，与一些混合的

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