肉制品中酵母菌的出现与生长——潜在的影响腐败

Dennis S. Nielsen, Tomas Jacobsen, Lene Jespersen, Anette Granly Koch, Nils Arneborg

摘 要 肉类产品的腐败一般归因于细菌，但新的加工和储存技术能有效抑制细菌的生长。因此，酵母菌成为了导致肉制品变质的主要菌群。为了更深入地了解五种不同的肉制品（培根、火腿、意大利腊肠和两种不同的烤肝）的变质过程中，酵母菌的潜在作用，将酵母菌分别在肉制品的加工过程中、加工完成后，以及在保质期限末时进行分离、列举以及鉴定。

酵母菌在培根生产中被分离出达到4.2 log (CFU/g)单位。而在烟熏后的培根中酵母菌群又减少到低于1.0 log (CFU/g)甚至无法被检测出。一般情况下，在意大利腊肠、熟火腿和烤肝的生产过程中，只有少量酵母菌被分离出来。在终产品中，只有一小部分的终产品样品（3/30样品）中检测到少许酵母菌群1.0–1.3log (CFU/g)。在保质期限末，只在1/25样品中检测到酵母菌1.8 log (CFU/g)。

用表型和基因型相结合的方法来确定肉类制品生产过程中的酵母菌群。酵母菌群是混合了4-12株分离自不同的生产场所的混合酵母菌群。一般来说，Candida zeylanoides, Debaryomyces hansenii和Candida alimentaria被认为是占主导地位的酵母菌。此外，还有三株不曾被命名的酵母菌群被分离出来。从肉制品加工过程中分离出来的代表七种不同种类的十四株酵母菌和一种从改进的火腿包装中分离筛选出来出来的酵母菌，置于两个不同的温度（5℃和8℃）下，在一个含低氧或高二氧化碳（0.5%氧气，20%二氧化碳，79.5%氮气）环境的肉类模型底物中培养，结果14株酵母中有11株能够在肉的模型基板生长，其中C. zeylanoides, D. hansenii, Pichia guilliermondii 和 Candida sake达到10⁵times;10⁶log（CFU/g）水平。

关键词 酵母；加工肉类制品；腐败

1.简介

肉类产品的腐败是一般归因于细菌。然而，新的处理和存储技术抑制了细菌的生长，这可能导致了酵母菌成为肉制品腐败的主要菌群(Fleet,1992;Osei Abunyewa, Laing, Hugo, amp;Viljoen, 2000; Samelisamp;Sofos, 2003; Vanderzant, Chesser, Savell, Gardner, amp; Smith,1983)。据我们所知，已发表的研究对新鲜和加工后的肉制品中酵母菌的出现和生长是有限的。鲜肉类往往与Candida,Rhodotorula, Debaryomyces和 Trichosporon等出现相关联(Fleet, 1992; Osei Abunyewa et al., 2000; Samelis amp; Sofos, 2003)。从盐渍、干燥、半干燥制品中分离出的酵母菌群，如发酵香肠，主要为耐盐Debaryomyces hansenii，包括Candida zeylanoides, Trichosporon ovoides，T.beigelii,Cryptococcus albidus 和 Rhodotorula mucilaginosa也存在 (Dalton, Board, amp;Davenport, 1984; Encinas, Lopez-Diaz, Garcia-Lopez, Otero, amp;Moreno, 2000; Fleet, 1992; Grazia, Suzzi, Romano, amp; Giudici,1989; Hsieh amp; Jay, 1984; Leistner amp; Bem, 1970; Osei Abunyewa et al., 2000; Saldanha-da-Gama, Melfeito-Ferreira, amp; Loureiro,1997)。只有少数的研究调查与培根相关，D. hansenii, Cryptococcus humicolus 和various Candida等是最常见的酵母菌群(Costilow, Etchells amp; Blumer, 1954; Gardner, 1971; Saldanha-da-Gama et al., 1997)。根据Gardner (1971)，培根中氯化钠的含量强烈的影响酵母菌与培根的关联程度。如果氯化钠含量高于4%，D. hansenii则为主要酵母，而在培根中氯化钠含量低于4%时主要为Candida tropicalis和Issatchenkia orientalis（Gardner, 1971）。据我们所知，与烤肝相关联的酵母种类还未被确定。

在某些情况下，酵母生长需要在与肉类产品关联。比如D. hansenii 和Candida utilis被报道出有利于香气的形成和红色香肠的稳定发酵(Dura, Flores, amp; Toldra,2004; Luuml;cke amp; Hechelman, 1987; Olesen amp; Stahnke, 2000)。然而，在大多数情况下，肉制品中存在酵母是不理想的，可能会导致肉制品的腐败，例如：肉制品的包装膨胀；在香肠表面粘液形成和改变颜色；以及产生异味等（Fleet,1992）。从食品安全的角度来看，有些酵母菌代谢有机酸和亚硝酸钠，是一个值得关注的问题，其后者具有双重作用，既能作为一种防腐剂又能作为肉制品中使用的粉红色染料剂的合成前体(Dalton et al.,1984; Fleet, 1992; Samelis amp; Sofos, 2003)。

尽管酵母菌生长在肉制品中有潜在的负面影响，但仍缺乏定量的研究调查酵母菌在肉制品的发生。本文的研究目标是量化和表明生产五种不同的肉制品过程中存在的酵母菌和探讨主要的菌株在加工肉类产品中的生长潜力。

2.材料与方法

2.1 采样及微生物的分离

以五个不同的猪肉加工肉制品为主的样本，包括发酵香肠，火腿，培根和烤肝（两家不同的生产商）和各自的加工场所（包括原材料，产品的生产日期和保质期），将在本研究中进行分析（采样地点和数量的样品显示在表1 - 5）。发酵香肠用真空包装，并在5摄氏度下保存，保质期为5个月。根据干燥的程度，发酵香肠干燥到体积分别减少分别25%和34%时，其水溶液中分别含有12%（重量/体积）和17%（重量/体积）氯化钠。火腿含有3.5%氯化钠，被气体填充（20%二氧化碳，0.5%的氧气和79.5%氮气），储存在5℃下，保质期为28天。培根含有6.9%氯化钠，被真空包装并储存在5℃下，保质期为37天。烤肝含有约3%-3.5% 氯化钠，存放在盖有塑料盖的锡纸容器中，于5摄氏度下通气保存，保质期为19天。取25g样品，用生理盐水稀释为1:10稀释液（SPO; 0.85% NaCl,(J.T. Baker, Deventer, Holland)，0.1%细菌蛋白胨(Merck, Darmstadt,Germany),pH 5.6）和搅拌60s（实验室搅拌机400，西沃德，伦敦，英国）。用于酵母的枚举，用十倍系列稀释液进行，且将适当的稀释液的等分试样（0.1毫升）接种在MYGP琼脂平板（3g酵母提取物，3g麦芽提取物，5g细菌蛋白胨，10 g葡萄糖，20克琼脂（BD）每1000毫升提供100毫克氯霉素(Sigma Co378, St. Louis, MO, USA)和50mg金霉素（Sigma，c4881）），在20℃下培养5天。从加工部位表面进行擦拭10 times;20厘米的面积（200平方厘米）收集的表面，用消毒纱布双向蘸SPO。再用无菌纱布擦拭，放置在一个含有50毫升稀释液并摇匀60 s。 根据需要制备稀释液并如上所述进行了列举酵母。空气样品的收集，既可以是被动的打开MYGP板2小时在现场取样也可以是积极的利用空气采样器2分钟，并使用MYGP条（在20摄氏度下培养5天）。

培养后，菌落形成单位数（CFU）被记录，并且从合适的部位随机挑取20个菌落，稀释再挑染和纯化，此方法出自Nielsen et al. (2007)。最终共获得803株酵母菌。纯化菌株在-80℃下长期保存在YGP肉汤（酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH = 5.6）含20%（w/w）甘油(J.T. Baker, Deventer, Holland)或保存在含20%甘油的脑心灌注液中。

2.2 酵母菌鉴定

分离的酵母菌根据其微观和宏观特征进行分组，以下将由Yarrow（1998）描述。对于每个组，一些菌株约对应于该菌株的平方根，在那组采用API ID 32 C试剂盒鉴定（产自法国生物梅里埃公司）和对D1/D2区序列26S rRNA基因进行测序，基本上根据Jespersen, Nielsen, Hoslash;nholt, and Jakobsen(2005)。

2.3占主导地位的菌株在肉类模型底物中生长的潜力评价

在低氧气/高二氧化碳下，用两种不同温度对八种不同种类的十四株酵母菌株，在肉类模型底物中（切片猪肉香肠）的生长能力进行了测试。在本研究中分离的十三株酵母占了七种不同的物种（图1）。另一株分离自加工后的腐败切片火腿中，被鉴定为假丝酵母，则作为对照（图1）。猪肉香肠有以下组成：肩，51.9%（w/w）；下颚，18%（w/w）；冰水混合物21.2%（W /W）；马铃薯淀粉，3.7%（w/w）；大豆粉1.4%（w/w）；酪蛋白EM-HV1.4%（w/w）；食用三聚磷酸钠N 15-15，0.3%（w/w）；氯化钠2%（w/w）所有添加剂购买于SFK（aveDoslash;，丹麦）。混合物乳化，再将香肠在80℃下巴氏杀菌1小时，核心温度达到75℃。用冷水淋凉香肠。将肉模型无菌切片（20克1厘米的薄片）在LAF板上（霍尔滕lasminair，阿勒oslash;D，丹麦）。用来接种的酵母取自-80℃下冷冻库存， 在BHI琼脂（默克）在20 ℃下培养5天，并在50毫升MYPG中培养5天。将得到的酵母菌培养物按1:100稀释，当0.1毫升的接种物被施加到香肠每一个切片的一侧，接种量为1.5-3 log（CFU/g）。2个相同的片被放置在23℃的含有20%二氧化碳，0.5%氧气和79.5%氮气的一个APET容器中（12.5times;6.5times;3.2厘米），氧传递速率为5毫升/平方米/ ATM / 24小时/ ATM，容器包装使用的托盘封口机（该公司T-200，wolfertschwenden，德国）。被存储在5摄氏度或8摄氏度下长达6周的时间。储存4周后，一些样品通过注射器被渗透到顶部箔，以评估酵母在大气条件下的增长。酵母生长模型基板被确定为如前所述。所有实验进行了重复。

氯化钠的浓度，水的百分比，脂肪百分比和pH值进行了分析如前所述(Jacobsen, Budde, amp;Koch, 2003)；D-葡萄糖、D-果糖和和蔗糖根据制造商的说明，通过酶法(Boeringer Mannheim Cat. No. 10716260035,Roche, Darmstad)进行了分析。在包的头部空间中的氧气和二氧化碳百分比采用CheckMate 9900测定(PBI Dansensor, Ringsted,Denmark).

图1. 在培根的生产过程和之后的腌制保存中所分离出的酵母菌

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