类黄酮是通过干扰大豆RNAi从而调控两个黄酮合成酶基因

原文作者 Yi Na Jiang amp; Biao Wang amp; Hui Li amp; Lu Ming Yao amp;

Tian Long Wu

摘要：类黄酮是植物生长过程中广泛存在的一类次生代谢产物。它们在植物抗紫外线伤害，生长素运输调控，以及花色调控中扮演重要角色。在大豆（Glycine max）中，黄酮合成酶II（FNSⅡ）是黄酮生物合成的关键酶。本研究根据其他物种中已经报道的黄酮合成酶基因序列信息，进行生物信息学分析，在大豆品种“合丰47”中通过反转录扩增得到两个FNS II基因，命名为GmFNSII-1和GmFNSII-2。根据序列比对表明，GmFNSII-1基因等同于大豆黄铜合成酶基因CYP93B16，而GMFCS -2是不同的基因。通过在裂殖酵母中进行酶活性分析，结果表明这两种酶可以催化（2S）-naringenin转化为芹菜素。两个GmFNSII基因有类似的组织特异性表达模式，但GmFNSII-2用0.4M葡萄糖处理后在根部表达。这表明该基因在大豆的胁迫信号转导过程中起着重要作用。通过发根农杆菌（ATCC15834）对大豆子叶的转化，在毛状根中发现GmFNSII基因能调节黄酮和异黄酮生产。我们还研究植物天然产物的代谢工程。

关键词：类黄酮，黄酮合成酶II，异黄酮，大豆，亚细胞定位。

缩略词

BLAST basic local alignment search tool

FNS II flavone synthase II

GmFNSII soybean flavone synthase II

MS medium Murashige and Skoog medium

NADPH reduced nicotinamide adenine

Dinucleotide phosphate

qRT-PCR quantitative RT-PCR

黄酮类化合物是公认的植物次生代谢物，已被报道的黄酮类化合物已经超过1万种（Tahara 2007）。所有的类黄酮是从两个基本合成代谢物—丙二酰-CoA和香豆酰-CoA到15-碳骨架以3：1的比例连接成。黄烷核由两个芳香环通过1个三碳链连接成，这涉及到一个额外的杂环六元环相邻的环上的酚基。类黄酮可以分为不同的种类，其中包括查尔酮，异黄酮，黄烷醇，花青素，黄酮醇，和黄酮（Kim et al. 2008; Fowler and Koffas 2009）。

植物类黄酮具有广泛的生理功能来防御生物和非生物胁迫。这些功能包括紫外线（UV）保护，生长素运输的调控，以及花色调控，被归为黄酮类化合物（Harborne and Williams 2000）。在大豆（Glycine max）中，异黄酮是最丰富的黄酮类化合物，在植物和微生物相互识别（Ferguson et al. 2010）中起重要作用。此外，发现异黄酮在人类健康和疾病预防方面有重要作用。例如，能降低胆固醇水平和预防某些癌症（Weisshaar and Jenkinst 1998; Lee et al. 2005; Kim et al. 2006; Kim and Lee 2007）。它们在改善激素依赖性癌症有重要作用，有助于女性健康（Beecher 2003）。

在所有的高等植物中，从黄烷酮到黄酮的过程主要是通过在黄烷酮杂环的C2和C3之间形成一个双键实现的。从黄烷酮产生黄酮过程中有两个酶系统-黄酮合成酶（FNS）I和黄酮合成酶II 。这两种酶不在同一个组织中，在欧芹crispum中发现FNS I，是可溶性的，Fe 2 依赖性的2-氧戊二酸-双加氧酶（Britsch 1990）。 FNS I是伞形科的成员，最近从单子叶植物也得到了FNS I（(Martens et al. 2001; ; Kim et al. 2008）。相反，FNSII是一种NADPH型和分子氧（Heller and Forkmann，1993），分子依赖性，蛋白细胞色素P450型单加氧酶，属于CYP93B家族。这种酶出现在高等植物中，如金鱼草。

在大豆和染料木素中，柚皮素涉及三条代谢途径中相关的关键酶， 苯基丙酸类代谢途径。形成黄烷酮-3-羟化酶（F3H）和形成三羧基异黄酮的异黄酮合成酶（Steele et al. 1999; Zabala and Vodkin 2005）， Fliegmann，（2010）描述诱导活性的黄酮合成酶，通过柚皮素被转化为芹菜素, 从大豆细胞培养物中得到GmFNS II(CYP93B16)。

在这里，我们报告两个从大豆GMFCS-1和GMFCS-2 II合成酶的克隆，我们对GmFNSII-1和GmFNSII-2进行序列分析。在毛状根里分析沉默的GmFNSII基因如何影响黄酮和异黄酮。我们的目标是获得新的代谢工程材料来提高生产异黄酮。

材料和方法

克隆和GmFNSII-1 、GmFNSII-2的序列分析

为了在大豆栽培品种“合丰47”中克隆得到GmFNSII-1（GU568027）和GmFNSII-2（GU568028）全长cDNA，我们从根部提取总RNA。24小时后取样，置于MS液体培养基中，MS培养基中加入0.4M的葡萄糖溶液，反转录为cDNA。

经过RT-PCR反应得到第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，设计两对引物 GmFNSII-1F / R， GmFNSII-2F / R，用PCR方法扩增全长GmFNSII cDNA，PCR产物克隆到pMD18-T载体并进行测序。

根据大豆基因组序列信息，进行BLAST比较，获得蛋白质序列和数据库的联系。构建发育树通过与MEGA2连接，经过1000重复生成带值。

体外测定酵母酶活力

GmFNSII-1和GmFNSII-2的编码区，在一个NMT1启动子的控制下，从起始密码子（ATG）到终止密码子结束，被克隆入PESP-2酵母（粟酒裂殖酵母）进行表达载体（Stratagene）的多克隆位点。构建载体，如 PESP-2载体（我们控制），被转化到酵母细胞。每个微粒制剂中的蛋白质含量为每布拉德福德检测（Bio-Rad）。我们执行体外微粒体酶试验Yu et al （2000）。

我们用上述提取物在Agilent 1100系列HPLC系统进行了分析，用一个Venusil MP-C18柱（(2.1times;150 mm, 5 mu;m; Agela Technologies,Inc.）。把样品在甲醇中稀释，然后用20％的乙酰甲，NOL-80％，10 mM醋酸铵（pH值5.6）上升至100％的甲醇进行18分钟线性梯度分离。流速为0.1毫升分钟-1。洗脱代谢物通过光电二极管阵列监测。保留时间和UV光谱与洗脱代谢物可用正常标准（Ralston，2005）比较。

RT-PCR定量分析GmFNSII-1和GmFNSII-2

总RNA从根部，茎，叶，花，未成熟的种子，不成熟的田间生长的“合丰47”来分离。植物样品用Trizol试剂（Invitrogen）处理，加入 DNA酶I，以第一链cDNA为模板，通过RT-PCR PrimeScripttrade;克隆。定量RT-PCR法用SYBR-Green和一个7300的实时PCR系统（Applied Biosystems）进行。初步结果根据阈值循环方法(Bovy et al. 2002）比较估计。使用作为内部标准抄本进行大豆肌动蛋白基因（V00450）的RNA制备。两对 PCR引物包括qRT_FNS-1F和qRT_FNS-1R，qRT_FNS-2F和qRT_FNS-2R（表1）。

葡萄糖处理，“合丰47”的种子放在受控气候室（16小时光照盆，25℃），取出土时小苗的第一对完全展开得真叶（约10天）。然后将叶苗置于一个补充有0.4M的葡萄糖的MS溶液中。根组织在处理24小时后收集。分离提取总RNA，用DNase I.分析。以上的RNA转录水平使用实时RT-PCR检测。

GmFNSII RNAi载体构建

构建的沉默GmFNSII RNAi载体。在GmFNSII-1和GmFNSII-2之间选择和322 bp的编码区有96％一致的，以 pMD18––GmFNSII-2为 PCR扩增模板，两对不同引物，正向引物序列5-CTG（ATCGAT /GGTACC）AAC TCGA ACCATTATO-3，和反向引物序列5-CCGG（TCTAGA / CTCGAG）GTTTACGCAAACTATTGAACCT-3建立限制性酶切位点。PCR产物克隆到两种相反方向的pHANNIBAL，一个PDK内含子，一个倒置重复的CaMV35S启动子（Wesley et al. 2001）。这个GmFNSII RNAi构建克隆到植物表达载体p1304 PBI121，通过加入35S：从pBI121的GUS片段插入pCam-bia1304。新建成的pCAMGUS，GmFNSII-RNAi载体插入到发根农杆菌ATCC15834，转化到大豆子叶以p1304 PBI121作为对照。pHANNIBAL，p1304 PBI121和发根农杆菌都从唐医生（Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology Ramp;D Center）获得。

大豆子叶转化

发根农杆菌的野生型和转化的菌株，挑取酵母蛋白胨（YEP）琼脂培养基上的菌株，培养植物接种接种到含有50微克毫升-1卡那霉素的10mL YEP肉汤培养基中，28℃过夜生长。4℃，5,000rpm 离心10分钟，残留的培养液倒出，然后重悬，最终OD值 600

大豆种子贮存在冷室中，表面用70％乙醇消毒1分钟，然后放在100毫升15％的Clorox中30分钟，不时晃动。之后，每培养基（MS基础0.4毫克L-1 6-BA）中放10粒种子萌发。子叶转化方法如下：种子在26℃，16小时的光周期下放5至7天。表面没有瑕疵的胚，在叶柄0.3厘米处取样，大致呈圆形的切口（0.4厘米直径）。切割的6组子叶叶柄加入20微升的发根农杆菌。然后将平板封上封口膜，在22℃，12小时的光周期下生长(Subramanian et al.2005)

GUS表达的组织化学分析

转化3周后，毛状根使用PC ANGUS-GMFS - RNAi载体浸渍在GUS， 0.05％的5-溴-4-氯 - 吲哚基 - beta;-葡萄糖醛酸苷eth;和一个100毫含有10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.1％的Triton和0.5mM K 4的Fe（CN）6·6H 2 O中。组织在37℃（Jefferson et al. 1987）染色24小时。停止该处理，取出根并用70％的乙醇洗涤。 GUS在解剖显微镜（Olympus SZX12）下，染可视化。

HPLC分析类黄酮

以评估其类黄酮成分，用100毫克转基因根在液态氮中研磨，通过超声（100瓦），用400mL 80％的甲醇提取2小时。HPLC，在236纳米上的Agilent 1100系列HPLC分析系统中，采用一个Venusil MP-C18柱。样品通过在0％至55％乙腈的线性梯度分离HPLC级水（pH3.0用磷酸调整），30分钟后，流速为0.2毫升分钟。

结果

两个候选GmFNS II从大豆基因组获得。使用BLAST搜索SoyBase栽培大豆基因组的数据库（http://soybase.org/SequenceIntro.php），我们从甘草echinata（CYP93B1 GeFNSII（51％）;

明石等， 1999年），苜蓿MtFNSII（53％）蒺藜（CYP93B12; Li et al. 2007）选择相似的序列。由此而来的序列与完整的开放阅读框（ORF）相匹配时，推出FNSII全长基因组序列。 更进一步的表明，它们是从“和丰47”获得并定为GmFNSII-1和GmFNSII-2。

GmFNSII-1和GmFNSII之间的ORF区域（CYP93B16，FJ767774）在氨基酸核酸水平超过99％以上的同一性，仅一个氨基酸不同。因此，我们认为它们是相同的基因，这里我们指的是GmFNSII-1。 GmFNSII-1（GU575289）和GmFNSII-2（GU575290）长度分别为2516和2,837 bp。它们之间的ORF区在核酸水平有93％的同一性，在氨基酸水平有95％的同一性。这两个基因在同一位置有相同的一个内含子，即，位置927启动密码子（ATG）。相反，它们的内含子序列结构是高度发散的。针对他们的cDNA序列ments，GmFNSII-1具有一个假定932-BP-长的内含子在GmFNSII-2 中是1253 bp长。

GmFNSII-1（GU568027）和GmFNSII-2（GU568028）的全长cDNA

通过RT-PCR从“合丰47”苗克隆得到。他们cDNA序列分析的62％和61％为GeFNSII（AB001380），76％和77％为MtFNSII（DQ335809）。推导的氨基酸序列为GeFN

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