盐胁迫逆境中不同抗性大豆品种

蛋白质组学比较研究

原文作者 Junhui Yan, Biao Wang*, Yina Jiang,

Linjing Cheng and Tianlong Wu

摘要：黄酮类，黄酮类化合物在大多数植物组织中一个主要群体，工厂环境中扮演多个角色交互。在我们的研究中,，两个大豆黄酮合成酶的表达基因，GmFNSII-1和GmFNSII-2中，显著增加通过茉莉酸甲酯（茉莉酸甲酯），葡萄糖，甘露醇和氯化钠处理，这也被发现增加黄酮苷积累在大豆。在GmFNSII-1启动子，在该区域的特定CGTCA序参与茉莉酸甲酯响应（979bp-806bp）被确定。 GmFNSII-2的启动子缺失分析揭示渗透应答（1,143bp-767bp）和葡萄糖抑制序列元素（767bp-475bp），强烈支持的假设：葡萄糖诱导大豆黄酮产量同时作为信号分子渗透系数和糖同时进行。GmFNSII基因沉默明显减少了生产总黄酮苷配基的产量（芹菜素，木樨草素和7,4 -二羟黄酮）在根源。该GmFNSII-RNA干扰（RNA干扰）的根是具有降低黄酮水平的，伴随着更多的丙二醛和过氧化氢积累比较对盐胁迫的敏感与对照中，我们得出的结论是黄酮，作为抗氧化剂，与耐盐性有关。

关键词：黄酮苷元、葡萄糖、茉莉酮酸甲酯、缺失分析启动子、耐盐性、大豆黄酮合成酶基因。

缩略语：DAB，3,3-二氨基联苯胺、 DFR，二氢黄酮醇还原酶、 DHF，7,4-二羟黄酮、FNSII，黄酮合酶II、 GUS，B葡萄糖醛酸酶、 JA，茉莉酸甲酯、LDOX，

无色花色素双加氧酶、MDA，丙二醛、MeJA，茉莉酮酸甲酯、MS，培养基、12-OPDA，12一氧一植物二烯酸、ROS，活性氧种类、RNA干扰，RNA干扰; RT-PCR，反向转录化-PCR、UF3GT，UDP-葡萄糖：类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶。

引言

黄酮类黄酮类化合物是由合成一个大类核心苯丙烷途径的分支。超过535黄酮约700黄酮糖苷，包括苷元结构，O和C糖苷，最近已被隔离。主要黄酮苷配基包括芹菜素，木犀草素，7,4-二羟黄酮（DHF），已经众所周知的防御功能化合物，信号分子和基因的调节病原体攻击时表达。作为参与非生物次生代谢产物生物胁迫，黄酮发挥重要而具体的角色在植物适应环境挑战和保护光合组织免受氧化损伤。

茉莉酸类（JAS），所述压力相关的激素，被证明能够提高植物中类黄酮的含量通过诱导几个基因的表达植物类黄酮生物合成。大豆异黄酮合酶的转录水平基因IFS1和IFS2分别由JA诱导，和一个显著由JA刺激IFS1启动子活性的增加在转基因拟南芥根检测到。在苜蓿研究苜蓿黄酮合成酶基因（MtFNSII-1和MtFNSII-2）揭示的表达MtFNSII-2 启动子-B-葡糖醛酸酶（GUS），而不是MtFNSII-1启动子在转基因蒺藜苜蓿升高由茉莉酮酸甲酯（茉莉酸）处理。 PtrCHS4的启动子，在类黄酮的关键酶生物合成毛果杨，包含两个保守这主要是负责G-box序列（CACGTG）对JA诱导。在大豆细胞培养物中，黄酮合成酶的活性二世(FNSII)显著增强通过JA，虽然JA响应序列中其启动子仍然没有界定。

许多研究已经表明在类黄酮的积累植物诱导糖。在这种生理过程，糖似乎不仅是营养源和诱导渗透胁迫，还充当了信号传导分子给激活/抑制类黄酮合成。据报道，大豆FNSII，由葡萄糖诱导，由于渗透胁迫反应而产生的。迄今为止，我们的知识对葡萄糖的诱导调节功能大豆黄酮仍然是有限的;因此，要解决这个问题是很重要的：葡萄糖是否充当渗透胁迫或糖信号因子大豆黄酮合成的调节。黄酮类化合物通过维护提高耐盐性活性氧（ROS）的稳态和缓解氧化损伤。土壤盐分是一个最先的限制大豆产量通过影响大豆发芽，生长，营养成分和产量的因素。高土壤盐渍化促进ROS的产生，并因此导致对蛋白质的氧化损伤，DNA和脂类。 ROS动态平衡是紧密通过ROS产生和清除系统控制。芹菜素（4 ，5,7-三羟基黄酮），一个丰富的黄酮苷元广泛分布于植物中，有已显示抑制脂质过氧化，消除自由基和提高内源性抗氧化防御。研究转基因植物表明氧化保护酶的表达或其他应激调控转录因子改良植物耐受非生物胁迫。

FNSII，膜结合细胞色素P450单加氧，转变的黄烷酮类直接进入黄酮类。两个大豆FNSII基因，GmFNSII-1（CYP93B16）和GmFNSII-2，已经被鉴定。这两个基因的功能在非生物胁迫反应仍不清楚。在这里，我们研究了两种基因的表达模式和茉莉酸甲酯下黄酮苷元含量，葡萄糖，甘露醇和NaCl处理。我们的特点上游该负责GmFNSII启动子活性区并确定了葡萄糖和茉莉酸反应元件GmFNSII-1和GmFNSII-2启动子的区域。此外，我们发现GmFNSII沉默大豆幼苗较敏感，对盐胁迫由于提高氧化产物[过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）在根部和黄酮类化合物的积累增强通过氧化损伤的缓解植物耐盐性大豆根。

结果

GmFNSII基因的启动子由多个非生物刺激大豆毛状根激活

为了窥探到GmFNSII基因的表达响应于非生物刺激，alpha;-1,672bp GmFNSII-1启动子和alpha;-1,143bp GmFNSII-2启动子分别单独构成GUS。 GUS活动进行了分析茉莉酸甲酯（100mM）处理的转基因大豆毛根，葡萄糖（0.4M），甘露糖醇（0.4M）和NaCl（100mM）。 如图 1，无论是启动子GUS报道清楚通过这些处理诱导的感应模式两个报道是相似的，也是可变的。虽然甘露醇在两个启动子产生类似的GUS活性，所述

茉莉酸，葡萄糖和NaCl处理诱发更大的GUS在GmFNSII-1启动子 - 报告基因表达。这些研究结果通过GUS组织化学检测进一步证实。该启动子 - 报道实验表明GMFS基因涉及大豆非生物响应。

GmFNSII基因和黄酮苷元的累积是由茉莉酸甲酯刺激

为了解决GmFNSII基因在植物非生物的作用反应，我们首先通过茉莉酸modu-确定它们的表达特征。在实行PCR分析， GmFNSII-1和GmFNSII -2的转录水平在大豆种籽的不同组织中被发现了100mM MeJA同时诱导处理。然而，这两个基因的诱导模式没有跨样品完全相同。GmFNSII-1和GmFNSII-2的峰值水平在对叶片（2.79- 1.97倍相比，分别与肌动蛋白）进行茉莉酸处理后1小时。和根（0.35-和0.32倍，分别）;而他们的最高的诱导（1.43- 0.97倍，分别）在处理（图2a）后在4小时茎发生。同时，GmFNSII-1的转录水平明显高于该GmFNSII-2中的控制和处理的大豆组织，而GmFNSII-2的表达是更敏感茉莉酸甲酯处理大豆根和茎（该转录标准化的水平，以控制forGmFNSII -1- vs.GmFNSII-2：176与372在1h内处理根; 93与331处理4H茎）。黄酮糖苷配基的含量（DHF，木犀草素，芹菜素）在不同的组织中4小时处理后测定用HPLC法（图2b）的100mM茉莉酸甲酯。如图所示在图2b，黄酮苷元的含量为主要积累在大豆叶和茎。这种积聚化与GmFNSII转录水平是一致的。随着GmFNSII基因的上调，黄酮苷元的水平在所有的处理的图被同时提高。值得注意的是，根具有最大增加（3.6倍）的茉莉酸甲酯诱导生产这些化合物。

在GmFNSII-1启动子茉莉酸甲酯顺式元件分别负责茉莉酸甲酯响应

这些启动子 - 报道构建体引入到通过改造大豆毛状根生成含有野生型芽复合大豆幼苗转基因根。有在MeJA-一个显著增加在1,672bp启动子 - 报道诱导GUS活性处理后24小时，并且979bp截短启动子报道（P1D1）仍保持85％的诱导（图3a）。但是，进一步的缺失启动子来806bp（P1D2）完全消除启动子的能力，以响应该茉莉酸甲酯处理（图3a）。因此，主茉莉酸甲酯响应序列映射到之间的区域979-806bp的GMFCS-1启动子。一贯与该发现，在GUS组织化学测定（图3b-d）中，最黑暗的染色是目前在P1（GmFNSII-1启动子）下的100mM茉莉酸甲酯处理的转基因发根（图3b），而P1D2同行中的唯一淡染相同的条件下（图3d）。这些GUS报道实验表明806bp 启动子（P1D2）只保留基础所述GmFNSII-1启动子（图3a-d）中的活性。调查是否预测茉莉酸甲酯响应主题（CGTCA）在启动子序列（从979-806bp）的GmFNSII-1负责茉莉酸诱导，我们替代内容与TCGAC共有序列来生成一个GmFNSII-1子突变。我们转变了这个GmFNSII-1启动报道突变成GUS组织化学大豆毛状根试验（Figs.3e，F）. 我们发现没有差异之间的GUS染色突变和正常GmFNSII-1发起人——报道在正常条件下;，然而，

与突变报道根部呈轻得多染色茉莉酸处理后，露出了活动减少。该结果表明，该CGTCA主题是一个真正的茉莉酸顺式元件。

由葡萄糖和甘露糖醇诱导GmFNSII基因的差异表达的组织

为了研究是否渗透作用或糖特定效果与葡萄糖对黄酮的功能堆积有关，该非代谢甘露醇被用来在系统中创建的渗透压梯度。GmFNSII-1和GmFNSII-2中的根的转录水平，茎和在大豆幼苗阶段离开检测V1通过在0.4Mglucose和0.4Mmannitol应力实时PCR。继处理，GmFNSII-1的表达和GmFNSII-2增加了葡萄糖和甘露糖醇并且在所有处理后达到了2-4小时的最高水平组织，具有最高的表达水平在叶片中发现为两者的处理（图4a，b）中。有趣的是，甘露醇似乎是GmFNSII表达比葡萄糖更有效的诱导剂; GmFNSII-1的峰值水平（甘露醇与葡萄糖处理）分别为101-与倍2.6，71-分别304-与2.9倍和与62-叶片折叠inductiton，茎和根，（图图4a）。类似的表达模式也被发现GmFNSII-2在两种处理（图4b）。这些结果也与GmFNSII-GUS转基因发根的GUS活性测定根据葡萄糖和甘露糖醇的应力（图1;补充图S1）相一致。经过2小时处理测定用0.4M葡萄糖黄酮苷元的内容和0.4M甘露糖醇（图4c）。在以下葡萄糖和甘露糖醇处理，以GmFNSII mRNA的表达一致叶片中观察到的最高水平。黄酮苷含量根（3.55毫克G_1 FW），茎（6.97毫克G_1 FW）和甘露醇治疗后叶（9.62毫克G_1 FW）为5.4-，3.7-和5.7倍，比对照高。葡萄糖导致了3.3倍（根，2.17毫克G_1 FW），2.7倍（茎，5.02毫克G_1 FW）和2.2倍（叶子，5.02毫克G_1 FW）增加黄酮苷含量后2小时的处理。

响应于葡萄糖的基序存在于GmFNSII-2启动子

通过分析一组截断GmFNSII-2的启动子（P2）（图5a），我们发现，转基因毛根进行葡萄糖应力24小时显示出GUS活性的急剧下降至58％时，启动子是从_1,143删除英国石油公司（P2，GmFNSII-2子）至_767 BP（P2D1）。有趣的是，最小的启动子报道（475bp，P2D2）透露了一个更高的GUS 活性量比较大的，P2D1。这些结果表明该GmFNSII-2启动子可能包含正面（在1,143和767bp间）和负调控区域（767bp和475bp之间）参与葡萄糖响应。基于生物信息学分析，进行脱水反应元件（804bp）和糖抑制元件（714bp）在GmFNSII-2启动子进行了预测。从GUS组织化学测定获得我们的数据（图5b-d）中支持这一预测。根据0.4M葡萄糖应力，到GUS积聚显着降低至与启动子序列的缺失一个较低的水平（从1,143bp767bp），在P2和P2D1的转基因根部染色结果（图5b，c）所示。与GUS的观察结果一致。启动试验中，GUS染色葡萄糖被恢复强调P2D2转化体的水平类似于P2的根（图5b，d）所示。尽管中活动的差异所述GmFNSII-2葡萄糖处理截短启动子，GUS水平，这些启动子报道可比的正常状态下（图5b-d）中。由于有脱水反应和糖压抑地区的启动子GmFNSII-2，我们推测，葡萄糖可以增强通过其渗透功能和葡萄糖水平黄酮还可能通过调节动作合成黄酮对糖镇压元素。

黄酮产量与大豆耐盐相关

为了确定在盐胁迫大豆黄酮生产中，我们处理的大豆苗用不同浓度的NaCl 24小时。在处理过的大豆叶，茎和根，GmFNSII-1和GmFNSII-2的表达和黄酮苷元含量显著增加（图6a，b）中。GmFNSII-1和GmFNSII-2的转录水平在150MM氯化钠处理叶（0.26和0.07与肌动蛋白相比，分别）达到峰值，而感应未进一步增强由200mM的氯化钠，可能归因于严重枯萎离开所造成的盐胁迫。最高mRNA水平茎（0.11和0.02与肌动蛋白相比，分别地）和根（GmFNSII-1，0.11，与肌动蛋白相比）中检测到200mm的NaCl处理。在100mm的NaCl处理，我们发现，在根黄酮苷元含量（1.92毫克g_1FW）是显著比对照（0.65毫克G_1 FW），最高黄酮产量（2.63毫克G_1 FW）的更高的观察150MM NaCl处理（图6b）。黄酮糖苷配基的叶片中的峰值水平与茎在200mm的NaCl处理中。

要确定黄酮苷元的大豆耐盐性的作用，我们通过RNA干扰（RNAi）的方法沉默GmFNSII基因大豆毛状根的表达，生成包含转基因毛状根和非转化芽菊科植物。为了评估GmFNSII沉默盒的脱靶效应，基因同源G

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