自发无色不成熟表观突变番茄体细胞遗传相关甲基化酶的必要条件

摘要：自然产生的表观突变体很少并且主要表现在植物中。然而这些突变体如何维持它们的表观遗传标记以及它们是如何遗传仍然是未知的。我们发现在番茄中需要SlCMT3和其他甲基转移酶来维持自发的突变及其同源的Cn表型。我们筛选了一系列能够改变超甲基化Cnr突变体的甲基化相关基因。调节发育的SlCMT3基因的沉默导致LeSPL-CNR的表达增加,这种基因编码SBP-box转录因子并且触发Cnr果实正常成熟。其他关键的影响成熟的基因表达也提高了。针对性的亚硫酸氢盐全基因组测序显示诱导Cnr果实成熟与 LeSPL-CNR启动子上一段286bp区域上的CHG位点的甲基化减少及与LeMADS-RIN结合位点有关的差异甲基化区域的甲基化减少有关。我们的结果表明,可能有不同的甲基转移酶的协同效应作用于Cnr的形成而且植物特殊的SlCMT3对于维持Cnr 表观等位基因至关重要。DNA甲基化维持的动力学对于Cnr突变体体细胞稳定的维持和番茄不成熟表型的遗传至关重要。

自发的表观遗传体可能来自于基础序列没有变更的DNA甲基化上的遗传性变异，但是这些变异能影响基因表达并与表型相关。的确表观突变体能影响植物和动物的近交性状。然而，自然的表观遗传变异是罕见的而且关于自发突变体如何保持其遗传稳定性也被知道得很少。在植物中，甲基化是通过DRMs，CMTs和植物特有的CMTs的结合酶活动发生在胞嘧啶的CG、CHG和CHH位置。这些酶对于RdDM和甲基化的维持是必须的。在拟南芥中，DRM2催化所有序列上的甲基化而且CMT2参与不对称的甲基化而MET1，MET3和DRM2分别参与CG,CHG和CHH位置上甲基化的维持。

番茄的Cnr是最具特点的自发形成的突变体之一。Cnr不同于拟南芥，甜瓜和油菜中的CmWIP，FWA，FOLT1和SP11这些结构上的表观变异。这些表观遗传改变可能由转座子或反式作用的小分子RNA，或者遗传的不成熟突变体，成熟抑制剂引起。Cnr突变体在LeSPL-CNR启动子的286bp区域上含有18 个甲基化胞嘧啶而且表型是非常稳定的。我们只研究大量生长超过20年的果实中回复反应显示红色条纹的4种Cnr果实。在本文中，我们用VIGS为基础的基因功能筛选，有针对性的全基因组DNA甲基化谱和荧光定量RT-PCR检测来研究Cnr的体细胞遗传机制。我们发现SlCMT3沉默导致DNA甲基化的减少以及Cnr在番茄中成熟的逆转。我们的研究结果表明，SlCMT3可能与其他关键部件包括SlCMT2，SlCMT7和在 RdDM和甲基化维持途径中的SlMET1有关，是Cnr 表观等位基因的维持所需要的。而且CMT3在结构基因的表观遗传调控上具有重要作用，比如作用于DNA重复序列和转座子相关序列的甲基化维持的转录因子。

结果

DNA甲基化相关基因的沉默影响Cnr果实成熟。Cnr表型可以通过的LeSPL-CNR的表达，或通过在286 bp区域的甲基化水平的提高重新变成正常果实，这表明是过度甲基化导致的表型。LeSPL-CNR启动子286bp区域上的18个甲基化胞嘧啶被认为是负责非成熟表型的（图1a）。为了了解维持Cnr表观等位基因稳定性的机制，我们用以马铃薯X病毒为基础的VIGS去使包括SlDRM7，SlCMT2，SlCMT3和SlCMT4在内的这些与DNA甲基化相关基因沉默（图1b）。这些基因是基于序列同源性被选择来很好地标示拟南芥DNA甲基转移酶的特征。对应每个SlDMT基因的特异性cDNA片段本克隆进以 PVX为基础的VIGS载体(图1b)。值得一提的是，VIGS诱导的序列上核苷酸相似性几乎只有30%或更低。考虑到植物中沉默诱导和小RNA介导沉默间完美互补的需要，我们预计，包括PVX/SlCMT2和PVX/SlCMT3这些结构应该达到基因特异性沉默的预期基因的目标。

的确，经由SlDRM7，SlMET，SlCMT2和SlCMT3沉默诱导的Cnr成熟程度不同(图1c-e)。特别是通过PVX/SlCMT3的SlCMT3的沉默，以SlCMT3的mRNA编码区为目标，造成Cnr果实比用TE缓冲液模拟接种或PVX注射的果实早约4天到达失去叶绿素的阶段。SlCMT3沉默的果实继续达到几乎完全成熟（图1f）。靶向SlCMT3 mRNA 的3rsquo;-UTR的PVX/SlCMT3_UTR 也能触发Cnr果实成熟(图1g)。然而，并不是所有的CMT基因是必要的来维持Cnr，因为SlCMT4沉默对成熟没有影响(图1h)，进一步证明所观察到的成熟表型是由于具体的SlDMT构建的基因特异性沉默(图1b-i)。

60%以上的水果在开花后5–15天分别注射PVX / SlCMT3，PVX/SlCMT3_UTR或发育成熟表型的PVX / SlCMT2。只有约29% PVX / SlMET1和48%的PVX /SlDRM7处理的果实成熟了。PVX/SlCMT4处理后有不成熟的Cnr果实，可能是载入空的VIGS载体PVX或者是模拟接种(图1i)。值得一提的是，不成熟被在注射PVX/SlCMT3的rin果实中观察到。总之，我们的研究结果表明，SlDMT_S在RdDM和甲基化维持途径中是需要的来保持不成熟Cnr表型的自然突变体的稳定性。

图1

调节发育的SlCMT3可能是维持Cnr表观等位基因的关键调制器。在拟南芥中，CMT基因主要与转座元件的胞嘧啶甲基化相关。因此，SlCMT2和SlCMT3引起Cnr成熟是令人惊讶的。同样引人注目的是，SlCMT3沉默比起SlDRM7或其他SlDMT_S沉默对Cnr表型的回复影响更大(图1)。这些表型的差异可能是由于在技术效率上的差异，虽然这是不可能的因为PVX系统在番茄基因沉默上是非常有效的。另外，我们的研究结果表明，SlCMT3在维持例如Cnr表观等位基因上比SlDRM7和其他SlDMT_S扮演更重要的角色。这与LeSPL-CNR表观突变区域的CHG过度甲基化有关（图1a），它主要由SlCMT3维持。我们认为这些数据意味着SlCMT3可能是Cnr表观突变体稳定遗传的关键基因调控之一。

这个事实就是SlCMT3的表达支持发育调控。SlCMT3的表达在发育中的Cnr果实中极大地发生变化，在未成熟阶段表达极高，在成熟的绿果中下降(图2)。在不成熟的Cnr果实中SlCMT3表达水平很高以至于它们他们比在正常和Cnr果实发育的其他阶段的植株矮。SlCMT3转录物在后期阶段下降到更低水平之前会在果实中再一次上调。正常的果实中SlCMT3表达在绿色期最高，但明显低于不成熟的Cnr果实，并且在断路器阶段下调。在野生型和Cnr果实中SlCMT3突出定量表达之间的差异表明SlCMT3高水平表达可能与Cnr表观状态的维持相关。

图2

SlCMT3沉默提高LeSPL- CNR和其他关键成熟TF基因的表达。剖析SlCMT3表达导致Cnr成熟逆转的机制，我们分析是否是SlCMT3沉默影响LeSPL- CNR和其他成熟的转录因子（TF）基因，包括LeMADS-RIN，LEHB1，SlAP2a和SlTAGL的表达。在注射PVX /SlCMT3的果实（图3a）中病毒RNA的急剧下降并且触发沉默的SlCMT3 RNA被检测(图3b)。成熟果皮中内源SlCMT3 mRNA明显减少，虽然在相同的果实弱成熟组织中只观察到一个温和的下降(图3c)。对比在沉默果实中SlCMT3 mRNA表达的降低，与控制水平相比LeSPL-CNR上调(图3d)。LeMADS-RIN，SlAP2a和SlTAGL1也上调，虽然LeHB1表达无明显影响(图3e-h)。应该指出的是，所有的被检测的TF_S在正常和Cnr果实中调节发育，虽然它们的表达水平不同，但一般都远低于Cnr。这些结果表明，通过SlCMT3沉默的Cnr成熟回复机制不仅与LeSPL-CNR的表达，也与其他成熟相关的TF基因是负相关的。然而，对于SlCMT3的VIGS如何影响后熟TF基因的表达尚待研究。很可能这种影响是成熟或者LeSPL-CNR表达变化的副作用，或是由于这些TF基因启动子甲基化的改变。

图3

SlCMT3的沉默提高了参与生物合成和催熟激素乙烯信号转导的基因的表达。我们还研究了 Cnr成熟过程中乙烯的生物合成基因SlACS1，SlACS2，SlACS4和SlACO1，和两个乙烯信号转导基因SlEBF1和SlEBF2的表达。与成熟相关的TF基因表达上调一致，在SlCMT3沉默的成熟果皮组织中所有与催熟激素相关基因都上调(图3i-m)。的确，TF_S比如LeMADS-RIN已知能调节乙烯生物合成基因的表达。也有可能是SlCMT3参与这些基因的表观遗传调控,因为SlCMT3沉默的果实在其启动子区域的DNA甲基化水平降低，或者说，它们的上调是直接或间接的LeSPL-CNR的下游效应。

SlCMT3沉默减少了LeSPL- CNR启动子表观突变区域的甲基化胞嘧啶。靶向测序法检测了SlCMT3沉默的果实中LeSPL- CNR启动子上286 bp区域及其侧翼序列的甲基化。在Cnr的18 个完全甲基化的胞嘧啶残基中，8个特定的胞嘧啶甲基化情况明显减少，7个位于CHG位点，1个位于CG框上(图4a)。在286bp区域上下游没有发现明显的甲基化差异。这些结果表明这8个的胞嘧啶的甲基化状态是LeSPL-CNR启动子活性的抑制作用的关键，而这些残基的甲基化的减少可能引起LeSPL-CNR表达增加；导致表观突变体果实Cnr的成熟。考虑到基因特异性VIGS(图1)， SlCMT3还原在8个特点胞嘧啶残基上的影响似乎依据功能性细化了。

图4

SlCMT3沉默对全基因组DNA甲基化的影响。通过全基因组测序SlCMT3沉默的Cnr果实的单碱基分辨率进一步被描述，而且确认在286 bp的启动子区域8个甲基化胞嘧啶的缺失（图4a,b）。此外，我们观察到，全基因组的低甲基化发生在CHG以及重复序列和基因区域上的CG和CHH位点(图4c-e)。发生在CG和CHH位点的甲基化不可能是由于PVX / SlCMT3介导的VIGS的其他DMT基因非特异性抑制(图1)，虽然这种甲基化减少的潜在机制还需要进一步的

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