小鼠少突胶质前体细胞扩增纯化新方法

原文作者：Junlin Yang, Xuejun Cheng, Jiaxi Shen, Binghua Xie, Xiaofeng Zhao, Zunyi Zhang, Qilin Cao, Ying Shen and Mengsheng Qiu 单位：杭州师范大学生命与环境科学学院发育与再生生物学研究所，浙江省器官发育与再生重点实验室，浙江杭州

摘要：尽管转基因和基因敲除的小鼠被广泛用于研究少突胶质前体细胞(OPCs)的规格化和分化，但小鼠原代OPCs难以纯化和维持活性，许多体外研究不得不求助于大鼠OPCs作为替代品。在这项研究中，我们呈现了小鼠O4阴性的早期OPCs可以通过培养皮层组织块获得，并用血小板衍生生长因子-AA（PDGFaa），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子同时培养OPCs，同时EGF是小鼠OPC在培养中繁殖的关键。研究发现EGF是OPC的有效促分裂原，可与PDGFaa协同作用以扩展细胞分裂并抑制其分化。EGF还与PDGFaa和bFGF协同作用，将双极性或三极性OPCs转化为更有活力的成纤维细胞样OPCs，而不会损害其少突胶质细胞的分化潜力。此外，EGF促进了原代OPCs培养物中神经胶质前体细胞（GPC）的存活和增殖，可以在EGF，bFGF和PDGFaa的存在下获得GPC和OPC的混合物并进行繁殖。一旦撤出EGF，GPC数量急剧减少，成纤维细胞样OPCs转变为典型的OPCs形态，随后获得均质的OPCs。

关键词：OPCs； GPCs； 共培养；EGF； 协同效应； PDGFaa； 分层培养

导语

在脊椎动物的中枢神经系统（CNS）中，少突胶质细胞（OLs）产生包裹轴突的髓鞘，以促进神经冲动的快速传导并支持轴突存活（Marinelli等，2016）。在产后大鼠视神经细胞的培养物中首次鉴定出产生OLs的少突胶质前体细胞（OPCs）。它们是双能GPCs，在确定的培养条件下可以分化为OLs，或者在胎牛血清存在的情况下可以分化为2型星形胶质细胞（A2B5 / GFAP ）（FBS； Wang等，2013）。因此，它们最早被称为少突胶质细胞-2型星形胶质细胞（O-2A）前体细胞（Tanner等，2011）。OPCs最初在培养物中通过其A2B5抗原表型和双极性或三极性形态来鉴定，但后来发现了更特异性的分子标记，例如血小板衍生的生长因子受体alpha;（PDGFRalpha;）和基本的螺旋-环-螺旋转录因子Olig2（ Lu等，2002； McKinnon等，2005）。早期OPCs大多为O4-阴性，而晚期OPCs沿少突神经胶质谱系发展时则开始获得具有多极形态的O4抗原（Yang等，2011）。

少突胶质前体细胞广泛用作模型系统，以探索体外控制少突胶质细胞分化和轴突髓鞘形成的分子途径，以及某些脱髓鞘疾病的致病机制（Clemente等人，2013）。建立原代OPCs的培养条件可以为研究发展/病理机制和基于移植的髓磷脂修复研究提供大量纯化的细胞（Windrem等，2004； Cao等，2010）。迄今为止，原代OPCs的分离和扩增成功仍仅限于大鼠组织。已经开发出两种不同的从脑组织中分离大鼠OPCs的方法。一种是基于细胞表面抗原的细胞分选方法，例如免疫抗体包被筛选法（Yang等，2013）和荧光激活的细胞分选（FACS； Sohn等，2006），其细胞纯度取决于特定的表面抗原。但是，在中枢神经系统的其他细胞类型中可以发现许多OPCs的表面抗原，例如A2B5和NG2（Richardson等，2011）。另一种是基于胶质细胞不同粘附特性的震荡方法。然而，由于难以在小鼠组织中获得OPCs和星形胶质细胞的分层培养物，这种方法在很大程度上限于大鼠组织（Chen等，2007）。多项研究描述了通过从多能皮层前体细胞中形成“寡聚体”获得小鼠OPCs的方法（Chen等，2007； Pedraza等，2008），但规模有限，其遗传、表观遗传或分子特性可能与体内的同类不同。由于小鼠广泛用于转基因和基因敲除研究中，因此在体外研究纯化的OPCs细胞对少突胶质细胞分化或轴突髓鞘形成表型的分子或信号传导机制变得越来越重要（Clemente等人，2013； White和Krauml;mer- 阿尔伯斯（Albers），2014年）。

在这项研究中，我们开发了一种获取小鼠皮层OPCs和星形胶质细胞分层培养的新方法，通过震荡从星形胶质细胞层分离的大多数OPCs是具有双极或三极形态的O4-。研究发现表皮生长因子（EGF）是OPCs的有效促分裂原，并与血小板衍生生长因子-AA（PDGFaa）协同作用，以促进细胞分裂并抑制其分化为O4 细胞。更重要的是，EGF促进双极或三极OPCs的形态变化为成纤维样GPCs，保持已确定的少突胶质细胞分化潜能并充当有力的促分裂原。从原OPCs培养物中分离出的EGF依赖的三电位GPCs也能分裂，并为混合培养物中的OPCs提供营养。从培养液中提取EGF后，成纤维细胞样OPCs转变为双极或三极形态，GPCs逐渐减少，从而获得了均质的原代OPCs。

材料和方法

大脑皮层组织分离

根据NIH《实验动物的护理和使用指南》，从出生后第1天的幼鼠中分离出小鼠大脑皮层（Chen等，2007）。用无菌处理过的刀片，在60mm培养皿中将大脑皮层组织切成1mm³大小，将切碎的组织重悬于新鲜制备的D / F20S培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM / F-12； Gibco，美国纽约州格兰德岛）加入20％v / v FBS（美国犹他州洛根的HyClone）和1％v / v青霉素/链霉素（P / S； Gibco； 每个大脑加入5 ml D / F20S培养基）。然后将组织上下吹打直至匀浆，将其转移到烧瓶中（将一个大脑转移到一个T25烧瓶中； Corning），并在5％CO₂中于37℃孵育。更换平面培养基后72小时，大多数皮层碎片附着在烧瓶上，一些扁平细胞开始移出组织。之后，每隔一天更换一次培养基。

OPC的分离和培养

随着扁平细胞不断从组织块中迁移出来，一些PB细胞出现在扁平细胞层的顶部。接种后第10天左右，混合的神经胶质培养物融合。通过用D / F20S培养基轻轻漂洗细胞培养物两次来除去漂浮的细胞，然后将培养瓶的瓶盖拧紧后，在420号摇床上，摇动15-18 h（37℃，250 rpm），轨道尺寸为1.0（Thermo Fisher，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）。收集细胞悬液，并通过孔径为40 micro;m的细胞过滤器（BD，Franklin Lakes，NJ，美国）进行过滤，以除去小块的星形胶质细胞，然后在室温以100times;g离心5分钟。将细胞重悬于OPC基础培养基中：补充有1times;N2（Gibco），1times;B27（Gibco），1times;P / S（Gibco）和0.1％w / v BSA（Sigma）的DMEM / F12（Gibco）加 10 ng / ml PDGFaa（PeproTech，美国新泽西州罗基希尔），然后转移至未经处理的培养皿（Corning）中，孵育30分钟，使星形胶质细胞和小胶质细胞附着在表面上，而OPCs保持悬浮状态。然后收集悬浮液中的细胞，并用血细胞计数器计数，然后将其铺板到包被有聚D-赖氨酸（PDL； Sigma，100 micro;g / mL）和层粘连蛋白（LN； Sigma，20 micro;g / mL； PDL / LN）的培养皿或板中（视需要而定）。

OPC分化

为了对OLs进行定向分化，将小鼠OPCs与在PDL / LN包被的载玻片上的（Millipore，Temecula，CA，美国）不含任何生长因子的OPC基础培养基一起培养3天，然后检查O4和MBP抗原的表达。对于星形胶质细胞分化，将OPCs在含有10％v / vFBS（HyClone）和1times;P / S的DMEM / F12（Gibco）的PDL / LN包被的小玻片中培养6天，然后用A2B5和GFAP抗体免疫染色。

生长因子对OPC增殖分化的影响

为了分析细胞增殖和分化，从星形胶质细胞层新鲜制备的OPCs按照1times;10⁴的密度铺板到每个涂有PDL / LN的24孔板中，然后再添加不同的生长因子或组合。再加入EDU（Life Technologies，Waltham，MA，USA）至终浓度为10 micro;M来分析细胞增殖。加入24小时后，将细胞在室温下于4％多聚甲醛中固定10分钟，然后通过Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒（Life Technologies）检测EDU阳性细胞，然后用O4或MBP抗体进行免疫染色。在荧光显微镜下从每个孔的三个不同区域计数双阳性细胞。结果用平均值和标准差表示。

OPCs和GPCs混合培养物的制备

从扁平细胞的上层分离后，将小鼠皮层OPCs悬浮在添加了10 ng ml^-1EGF（PeproTech），bFGF（PeproTech）和PDGFaa（PeproTech）的OPC基础培养基中，并以1times;10³cells / cm²的密度加入铺了PDL / LN的100 mm皿中。将细胞在37℃的5％CO₂中孵育，每隔一天更换一次培养基。在EGF bFGF PDGFaa的刺激下，原代OPC中早期的OPCs和少量的GPCs迅速分裂。OPCs和GPCs更牢固地附着在皿上，只能通过酶处理而不是通过震荡分离。借助胰蛋白酶消化几代后，基于它们的形态，成纤维细胞样的OPC和GPC增至约20–40％，而胰蛋白酶消化似乎并未显著减少前几代的细胞复制。

OPCs和GPCs混合培养物的OPC扩增

为了使小鼠OPC大量生长，我们在添加了bFGF（PeproTech）和PDGFaa（PeproTech）的培养基中，以1times;10³cells / cm²的低密度将OPCs和GPCs的混合培养物铺在PDL / LN涂层的100 mm皿上。隔天更换一半的培养基。在没有EGF的情况下，GPCs的分裂减慢，然后发生凋亡，而成纤维细胞样的OPCs则逆转为双极性或三极性形态，并继续增殖。混合细胞按1:5的比例每5天分裂2代，获得高纯度的OPCs。

脊神经节神经元（DRG）共培养用于髓鞘形成测定

与小鼠中的OPC相似，DRG也很难制备，因此我们必须求助于它们的大鼠对应物作为替代物。 如先前所述（Dadsetan等，2009）从E15 Sprague-Dawley大鼠胚胎分离DRG，并按照Dincman等.(2012)的方法培养轴突生长。将OPCs / DRGs共培养物在补充了30 ng / ml三碘甲状腺素（T3； Sigma）的OPC基础培养基中培养8–12天，并用抗MBP和抗神经丝（轴突）抗体进行免疫染色。

免疫荧光染色分析

如先前所述进行免疫染色分析（Yang等，2009； Dincman等，2012）。通过杂交瘤培养产生抗小鼠A2B5 IgM和抗小鼠O4 IgM（50％，v / v）。抗小鼠Olig2（1：1000），抗小鼠GFAP（1：1000）和抗兔神经丝（1：1000）购自Millipore。抗大鼠MBP（1：500）购自Abcam，抗兔beta;-微管蛋白（1：1000）购自Sigma，抗兔PDGFRalpha;（1：500）购自Santa Cruz。Alexa-488或Alexa-594偶联的二抗购自Invitrogen。核酸染料4rsquo;，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）获自Roche。所有定量数据均以平均值plusmn;标准差表示。通过学生的t检验评估了差异的统计学意义。P lt;0.05被认为具有统计学意义。

结果

小鼠大脑皮层组织原代OPCs的制备

当将小鼠大脑皮层组织与胰蛋白酶解离并涂在装有D / F20S培养基的PDL / LN包被的烧瓶中时，OPC和星形胶质细胞的分层培养未形成大鼠OPC制剂中描述的分层培养(图1B)（Chen等，2007）。但是，当将小鼠大脑皮层组织切成小块并直接铺板而不进行胰蛋白酶消化时，扁平细胞会从组织块中移出并形成一层床层，在其上会出现小的表面细胞（图1A）。绝大多数小的表面细胞表现出两个或三个细胞的过程（图1A），这是OPC形态的特征（Marinelli 等，2016）。

图1 |新生小鼠皮层组织培养的小鼠少突胶质前体细胞(OPCs)(A)培养4天后，扁平细胞从小鼠皮层组织中迁移出来，形成床层，在床层上皮层OPCs在第7天出现，第10天左右开始融合。(B)未形成游离的小鼠皮质细胞，OPCs和星形胶质细胞分层培养。(C)分离OPCs的形态。(D)扁平细胞为GFAP 星形胶质细胞。(E)原代小鼠OPCs培养中双极、三极和多极细胞的定量，n = 3。(F) OPCs对Olig2、A2B5和血小板源性生长因子受体alpha; (PDGFRalpha;)抗体免疫反应。(G)分离的原代OPCs培养物中Olig2、PDGFRalpha;、A2B5、O4、MBP和GFAP阳性细胞的定量，n = 5。统计分析以均数plusmn;标准差表示。比例尺(A-C): 100micro;m， (D,F): 50micro;m。

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