灰霉病菌的MFS转运蛋白对硫代葡萄糖苷分解产物具有耐受性，是其致病性所必需的

David Vela-Corciacute;a¹,Dhruv Aditya Srivastava ¹ , Avis Dafa-Berger¹ , Neta Rotem ¹ , Omer Barda 1amp; Maggie Levy¹

摘要

硫代葡萄糖苷主要在十字花科植物中积累，其水解产物在植物抗病性中起重要的作用。病原菌灰霉病菌对硫代葡萄糖苷具有不同的敏感性，但其对硫代葡萄糖苷反应的机制尚不清楚。将灰霉病杆菌暴露于硫代葡萄糖苷分解产物进行诱导，其主要促进剂超家族转运体mfsG的表达，而mfsG在真菌毒性化合物外流中起作用。在野生型拟南芥植株上接种灰霉病杆菌相比在硫甙缺乏的拟南芥突变体上能诱导更高水平的mfsG表达。缺乏功能性mfsG转运体的灰霉病杆菌菌株缺乏外排能力，它积累了更多的异硫氰酸盐（ITCs），因此在体外对这种化合物更敏感；它对含有硫代葡萄糖苷的植物毒性也较小。此外，mfsG介导ITC在酿酒酵母细胞中的外排，从而赋予细胞对ITC的耐受性酵母。这些研究结果表明，mfsG转运体是一种毒力因子，可增强对硫代葡萄糖苷的耐受性。

正文

植物防御病原微生物的关键机制之一就是植物抑制和植物结合素的产生，比如氨基酸代谢产物Camalexin和Glucosinolate（GS）。真菌病原体会利用各种致病性和毒力策略来有效地解毒或消除这些植物抗毒素，这一过程可以通过很多植物病原真菌中植物抗毒素的酶促转化来实现，而毒力消除则通过主动外排来实现，例如在番茄灰霉病菌中的植物抗毒素白藜芦醇和丁香酚。

在一些真菌中，ATP结合盒超家族转运蛋白（ABC）或MFS超家族（MFS）转运体的主动外流提供了针对各种有毒化合物的抗性，不仅包括次级代谢产物，还包括抗生素和杀菌剂，只有有限的ABC转运蛋白在发病机制中发挥作用，例如水稻上的稻瘟病菌ABC1、ABC3和ABC4， 葡萄和拟南芥上的灰霉病菌atrB，马铃薯上的赤霉素ABC1，小麦上的禾谷镰刀菌atr4。

值得注意的是，ABC和MFS转运蛋白并不局限于植物病原体，它们的主动外排也被许多其他生物利用。例如，在人类念珠菌病原体和曲霉属中，这些转运蛋白有助于对唑类杀菌剂产生耐药性，从而降低治疗效率。新型隐球菌的ABC转运体AFR1对氟康唑具有防御作用，并通过保护真菌免受宿主吞噬细胞产生的有毒化合物的侵害而发挥毒力因子的作用。乳酸杆菌的LmrA可能是研究得最好的细菌ABC转运体之一，它有助于细菌对抗生素的耐药性。

我们最近的研究表明，灰霉病菌对GSs及其降解产物表现出不同的敏感性，而油菜链格孢菌（alternariabrassicola）对GS及其水解产物的耐受性更强。虽然异硫氰酸酯（ITCs）和其他GS水解产物对一系列真菌的毒性已被证实，但其毒性机制以及真菌对GS水解产物的耐受或解毒能力仍不清楚。

灰霉病是一种死体营养型的植物病原体，寄主范围广（gt;200个寄主），包括在农业上重要的十字花科作物。它是灰霉病的诱因，在植物生长和采后阶段都造成了巨大的经济损失。灰霉病的防治依赖于化学杀菌剂的重复使用，这导致抗药性的迅速发展。因此，了解该病原菌对其宿主防御系统解毒的机制对于揭示其基本的细胞过程和制定控制该病原菌的新策略都至关重要。

在这里，我们报告鉴定了一个指定mfsG，参与ITCs解毒的B. MFS载体。该转运蛋白在体外不同ITCs存在下有差异表达，并且在与野生型拟南芥相互作用期间在植物体中上调。具有mfsG缺失（Delta;mfsG）的灰霉病杆菌分离物在体外对ITCs的耐受性较差，因此对拟南芥的毒力降低。在异源酿酒酵母系统中B.灰霉菌mfsG能够耐受苄基ITC（BITC），这进一步支持我们的发现，即mfsG在植物-病原相互作用过程中在GS分解产物的外流过程中起作用。

结果

ITCs对灰霉病菌菌丝生长有抑制作用。为了确定防御相关GS分解产物ITCs对灰霉病菌（分离株B05.10）的抑制作用，在不同浓度的丙基ITC（PITC）、BITC和2-苯乙基ITC（PhITC）存在条件下进行了径向生长试验。BITC和PhITC均以剂量依赖性的方式抑制放射状生长（图1a），而PITC的抑制作用较小（图1a）。B.灰霉病菌对BITC最敏感，400mu;M时完全抑制（100%）。相比之下，400mu;M PhITC下仅观察到70%的抑制（图1a）。

ITCs诱导MFS基因表达的鉴定。GS分解产物BITC的RNA-Seq分析揭示了16个有差异表达的MFS基因，其中只有一个被强烈上调并被指定为mfsG（未发表的数据；补充图1）。

ITCs诱导mfsG表达。使用不同浓度的BITC和PhITC进行定量实时PCR（qRT-PCR）分析，发现mfsG对BITC的反应上调（图1b）。mfsG的表达水平与BITC和PhITC浓度有关。随着BITC浓度的增加，mfsG的RNA拷贝的相对数量增加，并在300mu;M BITC处达到峰值。若高于此浓度，灰霉病菌无法生长，mRNA的相对定量也无法确定。与生长抑制结果相对应，存在PITC和PhITC时，mfsG与在BITC存在时表达量更低（图1b）。

mfsG基因敲除突变体在ITC外排中受损，并在体外被ITC抑制。mfsG的敲除突变体（Delta;mfsG-1和Delta;mfsG-2）未出现mfsG表达（图2a）。正如预期的那样，这些突变体的生长已经在低BITC浓度下受到限制（10mu;M；补充图2）。24h后，Delta;mfsGs在200mu;M BITC上被抑制65%，而野生型菌株仅被抑制20%（图2b）。在两个菌株Comp1和Comp2中，Delta;mfsG与完全的mfsG的互补恢复了mfsG的表达（图2a），并且与敲除系相比，BITC的生长抑制显著降低，达到与野生型菌株相当的水平（图2b）。此外，我们证明Delta;mfsG菌丝在ITC流出中受损，并且积累的荧光ITC（FITC）是野生型灰霉病杆菌的四倍（图3）。

mfsG的表达受植物体ITC含量的调控。为了研究mfsG在植物中的表达水平，我们使用了不同基因型的拟南芥，其GS水平不同：IQD1-过表达植物（IQD1^OE），其GS含量是野生型的两倍，双突变体cyp79B2/cyp79B3（cyp79B2/B3）仅积累野生型GS数量的四分之一，双突变体tgg1-3/tgg2-1（tgg1/2）抑制野生型GS水平，但在两种芥子酶水解酶中被削弱。用灰霉病菌接种突变体和IQD1^OE植株，并在接种后48h测定mfsG的表达水平与野生型植株进行比较。正如所料，在高GS水平（IQD1^OE）的植物中，mfsG转运蛋白上调，而在含低GS水平（cyp79B2/B3）的植物和不积累GS分解产物（tgg1/2）的植物中，mfsG转运蛋白下调（图4a）。

Delta;mfsG突变体在植物中的毒性较小。为了确定Delta;mfsG突变体对植物中GS水平的毒力，我们对野生型灰霉病菌、其敲除突变体和补充突变体对GS过表达和A型突变体拟南芥基因型进行了致病性试验。通过测定接种后72小时的病斑大小确定，灰霉病菌Delta;mfsG突变体对野生型拟南芥植物的毒力比野生型A低80%（图4b）。Delta;mfsG突变体对野生型植株、tgg1/2或IQD1^OE植株均未产生明显损伤，均形成正常或高水平的GS。然而，它们在双突变体cyp79B2/B3上产生的损伤大小与灰霉病菌野生型菌株产生的损伤相当，后者降低了GSs水平（图4b）。当用mfsG的灰霉病菌补体感染拟南芥野生型A、tgg1/2和IQD1^OE时，疾病严重程度达到灰霉病菌野生型水平（图4b）。

Delta;mfsG突变体表现出较低的双芽管频率。为了评价野生型、敲除突变型和补充型灰霉病菌的适应性，使用显微镜观察了灰霉病菌分生孢子萌发率和双芽管产生率。各菌株的发芽率均接近100%，差异不显著。然而，Delta;mfsG突变体在所有拟南芥基因型上的双芽管发生百分率均显著低于野生型菌株。突变互补后，双芽管的数量与野生型相当（图5）。在cyp79B2/B3和tgg1/2中观察到的双芽管数量最多，而在GS含量最高的IQD1^OE中观察到的双芽管数量最少，尽管不显著（图5）。此外，与野生型相比，用10mu;M BITC进行的体外分析也显示Delta;mfsG中的双芽管较少（补充图3）。

mfsG赋予酵母对BITC的耐受性。为了进一步研究mfsG的功能，我们测定了它诱导酵母细胞对BITC耐受的能力。野生型酵母细胞对BITC高度敏感；它们的生长在15mu;M BITC的存在下受到抑制，这是由活培养物的光密度和菌落形成单位的数量决定的（图6a）。有趣的是，表达B.cinerea mfsG（WT：：BcmfsG）的酵母细胞对BITC具有高度抗性（图6a），这也表现在转化酵母细胞在暴露于BITC下时比野生型细胞提前10小时达到其指数阶段的能力（补充图4）。此外，WT：：BcmfsG酵母细胞比野生型酵母细胞积累的FITC少40%（图6b，c）。

mfsG编码蛋白的结构分析和BITC结合分析。灰霉病菌mfsG蛋白质编码431个氨基酸，预测分子量为46kDa，有12个推测的跨膜结构域（图7a和补充图5）。利用Phyre2软件对mfsG蛋白进行三维结构建模，获得了与MFS通用底物转运体模板的100%置信度比对。当从膜侧面观察mfsG结构并旋转90°时，表明保守的12个跨膜alpha;-螺旋折叠排列成两个6个TM螺旋束，在它们之间的界面上形成一个空腔，可进入细胞质或细胞外区域，这取决于构象状态（图7a，补充图5）。当观察三级mfsG结构的疏水相互作用时，我们观察到膜内有疏水区域，而亲水区域在细胞表面或细胞内（图8c）。我们进一步进行分子对接，以绘制BITC分子和mfsG之间的相互作用图，从而确定该化合物的一个假定结合位点。这个假定的结合位点是由位于mfsG内部通道的残基形成的。提议的结合区域由残基Trp54、Phe254、Gln344和Phe369的芳香环形成（图7b）。测量BITC分子与这些残基的侧链之间的距离：与Phe254的最大距离为4.175Aring;，并且它通过一个氢键与Trp54结合（0.86Aring;）（图7c）。还使用PITC和PhITC进行分子对接（补充图6a，b）。PITC通过一个氢键与Trp54（2.63Aring;）结合，而PhITC通过一个氢键与Arg290（2.82Aring;）结合，两者都位于mfsG的中央通道。使用FITC进行的分子对接表明，它与mfsG中的Trp54（2.325Aring;）通过一个氢键结合（补充图6c）。SwissDock提供的热力学参数、全适应度和自由能（Delta;G）清楚地表明ITCs能与mfsG紧密结合（表1）。此外，我们还展示了其他GS分解产物（如腈分子）与mfsG的分子对接。尽管5-（甲基磺酰基）戊腈通过两个氢键与mfsG结合，一个与Trp54（2.08Aring;）结合，另一个与Arg290（2.47Aring;）结合（补充图6d），但苯甲腈通过一个氢键与Trp54（2.25Aring;）结合（补充图6e），但形成氢键所需的高自由能表明存在强烈的非自发结合这两种化合物的过程（表1）。与苄基氰化物（GS的另一种分解产物）的分子对接显示，没有与mfsG结合的位点，这也由估计的高自由能支持（表1）。使用与mfsG具有40%以上相似性的MFS蛋白质进行系统发育分析（图8a；补充表1）。序列比对显示在邻接系统图中存在两个具有良好代表性的簇。第一个簇包含mfsG和来自灰霉病菌BcDW1的一个密切相关的蛋白质，一个推测的核黄素转运蛋白，以及其他密切相关的蛋白质。分析表明，在灰霉病菌B05.10中还存在另外两个mfs样蛋白（基因id:BCINu 03g02910和BCINu 02g05130），它们属于一个单独的mfsG簇，与灰霉病菌T4、灰霉病菌BcDW1及其最近的近缘菌核病同源。对来自灰霉病菌B05.10的这三个蛋白质序列的结构比较表明，它们具有MFS基序和跨膜结构域的共同特征（图8b，d），但它们在氨基酸序列的许多残基上明显不同，例如组成mfsG核心通道的芳香残基；缺失残基之一是Phe254，它似乎参与GS衍生物与mfsG的结合，正如分子对接预测的那样模拟。尽管如此, 热力学分析表明，当使用来自灰霉病B05.10，T4和核盘菌的BITC和mfs样蛋白进行分子对接时，结合的可能性较低（补充表2），并且没有发现结合位点。这表明，灰霉病B05.10 mfsG对GS衍生物的解毒有特异性。

讨论

许多研究表明，真菌病原菌与寄主植物的相互作用是由次生代谢产物和相应的病原菌耐受性介导的。然而，这些研究主要集中在次生代谢物解毒的机制上，对于MFS转运蛋白作为植物-病原相互作用的关键组分所起的作用几乎没有数据积累。在以往的研究中，我们发现低GS含量的拟南芥突变体对灰霉病菌更为敏感，其他研究也表明灰霉病菌对GSs的敏感性是可变的，cyp79B2/B3对灰霉病菌的敏感性比野生型高。因此，我们和其他人的研究表明，拟南芥-葡萄孢菌的相互作用在代谢水平上受到宿主毒素产生和病原体敏感性变化的影响。在目前的研究中，我们成功地证明了MFS转运蛋白mfsG是影响灰霉病菌对含GS的芸薹科植物如拟南芥的毒力的关键

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